缺氧誘導(dǎo)因子1對大鼠心肌梗死及再灌注損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)是細(xì)胞在缺氧條件上下產(chǎn)生的核蛋白，由α和β亞基組成。在缺氧條件下，細(xì)胞核產(chǎn)生HIF-1與靶基因結(jié)合，促進(jìn)該基因轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞對缺氧的一系列反應(yīng)，在促進(jìn)紅細(xì)胞生成，血管生成，調(diào)節(jié)血管及促進(jìn)糖酵解方面有重要作用。缺氧誘導(dǎo)因子1在缺氧條件下對心肌細(xì)胞同樣發(fā)揮重要作用。 缺血預(yù)適應(yīng)(IP)作為心臟通過反復(fù)短暫的心肌缺血/再灌注而產(chǎn)生的一種自我保護(hù)機制，可以使HIF-1α的表達(dá)增加，對心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。鑒于

2、缺血時HIF-1α的表達(dá)是引發(fā)各種缺氧應(yīng)激蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在缺血的適應(yīng)性反應(yīng)中起核心作用，被認(rèn)為是內(nèi)源性保護(hù)機制的始動因子和共同途徑，因而可以設(shè)想缺血預(yù)處理可能是通過HIF-1α表達(dá)及其促進(jìn)下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)來發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)的。缺氧誘導(dǎo)因子1對大鼠心肌梗死及再灌注損傷的作用以及信號傳導(dǎo)通路尚不十分清楚?；诖耍覀冄芯苛薍IF-1α對大鼠心肌梗死及再灌注損傷的作用以及PKC的信號傳導(dǎo)作用，分為三個部分。 第一部分 心肌內(nèi)

3、注射HIF-1α進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染對大鼠心肌梗死的影響 目的：缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的核蛋白。由α和β亞基組成。在缺氧條件下，細(xì)胞核產(chǎn)生HIF-1與靶基因結(jié)合，促進(jìn)該基因轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞對缺氧的一系列反應(yīng)，在促進(jìn)紅細(xì)胞生成，血管生成，調(diào)節(jié)血管及促進(jìn)糖酵解方面有重要作用。缺氧誘導(dǎo)因子1在缺氧條件下對心肌細(xì)胞同樣發(fā)揮重要作用。 缺血預(yù)處理(IP)可以使HIF-1α的表達(dá)增加，對心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。但轉(zhuǎn)染H

4、IF-1α是否對心肌梗死具有保護(hù)作用尚不十分清楚，本實驗將對急性心．肌梗死模型大鼠進(jìn)行心肌內(nèi)注射HIF-1α,觀察HIF-1α對心肌梗死有何影響。 材料與方法：體重250-350克的雄性WiSta大鼠72只，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物部提供。將實驗分為三組，第一組為轉(zhuǎn)染腺病毒HIF-1α的Ad-HIF-1α組：第二組為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的Ad-null組(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組)；第三組為假手術(shù)組；每組以術(shù)后的不同時間處死取材分3天，7天，1

5、4天三個亞組，每個亞組8只。采用文獻(xiàn)方法建立心肌梗死模型。Ad-HIF-1α組Ad-null組在左室游離壁的三個不同部位分別注射50μg的Ad-HIF-1α和50μg的Ad-dull，然后關(guān)胸縫合。假手術(shù)組不結(jié)扎左前降支。轉(zhuǎn)染3天、7天及14天后，10％/水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)原切口下一肋間開胸，觀察心臟活動形態(tài)后活體取出心臟，迅速取材，去除左、右心房及右心室，沖洗后4％多聚甲醛溶液固定，沿左室長軸由心尖至心底做厚切片，將左室分為6片

6、，石蠟包埋切片，HE染色行形態(tài)學(xué)觀察，14天后測量心肌梗死面積；CD34-抗顯示毛細(xì)血管計算得毛細(xì)血管密度。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈法(RT-PCR)測定HIF-1αmRNA、VEGF mRNA表達(dá)，用VEGF試劑盒測定VEGF含量。 結(jié)論：心肌內(nèi)注射腺病毒HIF-1α，能增加HIF-1α和VEGFmRNA的基因表達(dá)；使血中VEGF水平升高；心肌毛細(xì)血管密度明顯增加；使心肌梗死面積明顯減少，對急性心肌梗死具有明顯的保護(hù)作用。 第二

7、部分 目的：缺血預(yù)適應(yīng)(IP)作為心臟通過反復(fù)短暫的心肌缺血/再灌注而產(chǎn)生的一種自我保護(hù)機制，對心臟的保護(hù)作用已為大家共識，Shiki等則在1987年首次證實預(yù)先5分鐘的冠狀動脈阻閉可明顯降低在體大鼠心臟持續(xù)缺血后再灌注心律失常的發(fā)生率。雖然IP現(xiàn)象已得到大家的共識，但其確切機制尚不完全明了，細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也未完全闡明。鑒于缺血時HIF-1α的表達(dá)是引發(fā)各種缺氧應(yīng)激蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在缺血的適應(yīng)性反應(yīng)中起核心作用，被認(rèn)為是

8、內(nèi)源性保護(hù)機制的始動因子和共同途徑，因而可以設(shè)想缺血預(yù)處理可能是通過HIF-1α表達(dá)及其促進(jìn)下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)來發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)的。而蛋白激酶C(PKC)的信號傳導(dǎo)對缺血預(yù)適后急性心肌梗死HIF-1表達(dá)有何影響尚不十分清楚?；诖耍覀冄芯苛巳毖A(yù)適應(yīng)后急性心肌梗死HIF-1表達(dá)有何變化及PKC的信號傳導(dǎo)作用。 材料與方法：體重250-350克的雄性Wista大鼠32只，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物部提供。將實驗分為四組，第

9、一組為缺血預(yù)適應(yīng)組(IP組)；第二組為單純急性心肌梗死組(MI組)；第三組為缺血預(yù)適應(yīng)加KPC抑制劑組(IP+I組)；第四組為假手術(shù)組(C組)。采用文獻(xiàn)方法建立心肌梗死模型。左前降支被結(jié)扎后建立心肌梗死模型，缺血預(yù)適應(yīng)(IP)組結(jié)扎左前降支5分鐘后松開套管，反復(fù)三次，然后結(jié)扎左前降支；缺血預(yù)適應(yīng)加KPC抑制劑組(IP+I組)預(yù)適應(yīng)前10分鐘靜脈注射PKC抑制劑白屈菜季銨堿(chelerythrine 5mg/kg iv)，然后結(jié)扎左前降

10、支；假手術(shù)組?不結(jié)扎左前降支。1天后，10％/水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)原切口下一肋間開胸，觀察心臟活動形態(tài)后活體取出心臟，迅速取材，去除左、右心房及右心室，沖洗后4％多聚甲醛溶液固定，沿左室長軸由心尖至心底做厚切片，將左室分為6片，石蠟包埋切片。HE染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，1天后測量心肌梗死面積。免疫組化染色(SP法)觀察HIF-1α表達(dá)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈法(RT-PCR)測定HIF-1αmRNA、VEGF mRNA表達(dá)，蛋白質(zhì)印記分析檢測H

11、IF-1α、VEGF的蛋白表達(dá)，術(shù)前術(shù)后用VEGF試劑盒測定VEGF含量。 結(jié)論： 1、缺血預(yù)適應(yīng)能使HIF-1αmRNA表達(dá)明顯增加，其靶基因VEGFmRNA也明顯增加，其蛋白表達(dá)有相同的變化。 2.HIF-1α表達(dá)是缺血預(yù)適應(yīng)重要的內(nèi)源性保護(hù)機制。 3.HIF-1α的表達(dá)是依賴于PKC激活的，PKC是HIF-1α表達(dá)的重要信號傳導(dǎo)通路。 第三部分 目的：缺血-再灌注損傷(ischemi

12、a-reperfusion injury，IRI)是重要的臨床現(xiàn)象。使用氧自由基清除劑、鈣離子拮抗劑、β受體阻滯劑等對抗鈣離子超載和氧自由基的措施對IRI的療效令人失望。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的核轉(zhuǎn)錄因子。最近的實驗表明，血紅素加氧酶(HO-1)可以抑制IRI，而HO-1編碼基因是HIF-1α重要的靶基因之一。二甲基乙二?；拾彼?DMOG)是脯氨酸羥化酶(Prolylhydroxylase)的抑制劑，可以顯

13、著地增強HIF-1a的活性。在缺血與再灌注損傷中，白細(xì)胞介素8(IL-8)是重要的損傷因子，其水平同缺血-再灌注損傷程度呈正相關(guān)。本實驗通過DMOG增強HIF-1α的活性，觀察HIF-1α活性與HO-1基因表達(dá)、IL-8水平的變化，探討HIF-1α對心肌缺血-再灌注損傷的影響。 材料與方法：選擇體重在250～350g的雄性大鼠32只(12-14周齡)進(jìn)行實驗(實驗動物由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物室提供)。將實驗分為四組，每組8

14、只。第一組：為DMOG處理組，在缺血與再灌注損傷模型建立前24h進(jìn)行腹腔內(nèi)注射DMOG，劑量為20ug/g。第二組：為鹽水注射組(saline組)，在缺血與再灌注損傷模型建立前24h進(jìn)行腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.5ml。第三組：為缺血預(yù)適應(yīng)(IP)組；第四組對照組，即假手術(shù)組。采用文獻(xiàn)方法[4]建立缺血與再灌注損傷模型，打開前胸暴露心臟(參閱第一部分)，結(jié)扎左前降支(剛分出第一對角支處)，30分鐘后打開結(jié)扎，再灌注180分鐘后迅速取出心臟。

15、缺血預(yù)適應(yīng)(IP)組結(jié)扎左前降支5分鐘后松開套管，反復(fù)三次，然后結(jié)扎左前降支30分鐘后打開結(jié)扎，再灌注180分鐘后迅速取出心臟，去除左、右心房及右心室，沖洗后4％多聚甲醛溶液固定，沿左室長軸由心尖至心底做厚切片，將左室分為6片，石蠟包埋切片。假手術(shù)組(對照組)不 結(jié)扎左前降支。180分鐘后測量心肌梗死面積，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈法(RT-PCR)測定HIF-1αmRNA、HO-1 mRNA表達(dá)，蛋白質(zhì)印記分析測定HIF-1α、HO-1及

16、Caspase-3的蛋白表達(dá)的蛋白表達(dá)，再灌注60分、120分采用大鼠眶靜脈采血0.5ml，再灌注180分用大鼠心內(nèi)采血，ELLSA試劑盒測定IL-8水平；MPO(髓過氧化物酶)試劑盒測定MPO水平。 結(jié)論：經(jīng)DMOG處理后，HIF-1αmRNA、HO-1mRNA表達(dá)明顯增多，心肌梗死面積明顯減少，Caspase-3的活性與IL-8的水平明顯降低，引起了類似延遲缺血預(yù)適應(yīng)的現(xiàn)象，表明HIF-1α對心肌缺血與再灌注損傷具有重要保護(hù)