舌癌耐藥相關(guān)基因(TCRP1)在口腔鱗狀細(xì)胞癌順鉑化療及放療耐受中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：口腔鱗癌(Oral squamous cell carcinoma OSCC)是最常見的頭頸部腫瘤之一，化療仍然是口腔鱗癌尤其是進(jìn)展期的口腔鱗癌患者的主要治療措施。順鉑(cDDP)是目前口腔鱗癌患者首選的化療藥物之一。然而，順鉑耐藥成為制約其臨床應(yīng)用的主要障礙。TCRP1是我們前期實(shí)驗(yàn)中，從舌癌耐藥細(xì)胞系 Tca8113/PYM中克隆出來的一個(gè)新基因，初步的功能研究發(fā)現(xiàn)在 Tca8113/PYM中沉默 TCRP1的表達(dá)后其順

2、鉑的敏感性明顯提高，相反在親本細(xì)胞中上調(diào) TCRP1的表達(dá)則顯著提高其對(duì)順鉑的耐藥性。因而推測 TCRP1可能是一個(gè)順鉑耐藥相關(guān)基因。本研究將基于以上體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，探討 TCRP1在口腔鱗癌組織中的表達(dá)及其與臨床順鉑耐藥的相關(guān)性；TCRP1在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中作用以及 TCRP1介導(dǎo)順鉑耐藥的機(jī)制。為進(jìn)一步闡明口腔鱗癌耐藥機(jī)制，開發(fā)新的逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 (1)從病理標(biāo)本庫中收集具備完整臨床資料的

3、口腔鱗癌標(biāo)本，根據(jù)對(duì)順鉑化療的情況分為敏感組和不敏感組。將所篩選出來的標(biāo)本制成組織芯片，通過免疫組化法檢測組織芯片中的’TCRP1的表達(dá)水平，然后對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量積分法分析。統(tǒng)計(jì)分析 TCRP1的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、化療效果及預(yù)后的關(guān)系。
　　 (2)無菌條件下收集新鮮口腔鱗癌組織，一部分組織制成單細(xì)胞懸液并種植于96孔板中，MTS法檢測其對(duì)順鉑藥物敏感性，另一部分進(jìn)行固定、石蠟包埋并制成組織芯片，免疫組化檢

4、測這些組織中 TCRP1的表達(dá)，然后對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量積分法分析，統(tǒng)計(jì)分析體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果與 TCRP1表達(dá)的相關(guān)性。
　　 (3)建立TCRP1高表達(dá)及沉默表達(dá)的口腔鱗癌裸鼠移植瘤模型，分別隔日腹腔注射等體積的生理鹽水、順鉑(3mg/kg)和5-Fu(30mg/kg)，然后觀測腫瘤生長情況并繪制生長曲線。給藥16天后處死動(dòng)物剝離腫瘤并固定石蠟包埋，制成組織芯片后免疫組化檢測TCRP1的表達(dá)，TUNEL檢測組織芯片細(xì)胞凋亡情況，分

5、析 TCRP1表達(dá)與裸鼠移植瘤的順鉑敏感性的關(guān)系。
　　 (4)為明確TCRP1在放療敏感性中的作用。利用前期建立的穩(wěn)定的。TCRP1過/沉默表達(dá)的細(xì)胞株，通過克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTT、彗星實(shí)驗(yàn)及凋亡檢測分析上述細(xì)胞株及其對(duì)照細(xì)胞的放射敏感性。
　　 (5)HPLC法檢測cDDP在細(xì)胞內(nèi)蓄積濃度變化，分析TCRP1對(duì)細(xì)胞內(nèi)順鉑的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。Western Blotting檢測TCRP1過/沉默表達(dá)細(xì)胞株中Akt信號(hào)通路相

6、關(guān)分子的表達(dá)改變，包括Akt、p-Akt、bcl-2、NF-κB、金屬硫蛋白Ⅰ(MT-Ⅰ)。利用免疫共沉淀技術(shù)檢測可能與TCRP1發(fā)生相互作用的蛋白。
　　 (6)免疫組化法檢測口腔鱗癌及裸鼠移植瘤組織芯片中p-Akt、金屬硫蛋白(MT)的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)舌癌組織芯片免疫組化的結(jié)果顯示：TCRP1表達(dá)主要定位于胞漿及胞核。在42例有完整臨床資料的舌癌標(biāo)本中，有26例 TCRP1陰性或弱陽性表達(dá)，

7、16例陽性或強(qiáng)陽性表達(dá)。TCRP1的表達(dá)與各項(xiàng)臨床病理參數(shù)包括性別、年齡、TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無顯著相關(guān)性。但是TCRP1與臨床療效有明顯相關(guān)，在 TCRP1表達(dá)(-)和(+)的患者中，緩解率達(dá)84.62％，而(++)和(+++)患者組中緩解率為37.5％。組間差異有顯著性(p=0.0301)。經(jīng)Spearman相關(guān)分析顯示兩者呈正相關(guān)(p<0.05)。相關(guān)系數(shù)R=0.582。
　　 (2)MTS法檢測腫瘤組織體外藥物敏

8、感性，32例舌癌組織中共獲得27例有效數(shù)據(jù)，其中敏感18例，耐藥9例，敏感率66.6％，這與臨床順鉑敏感率基本一致。通過對(duì) TCRP1免疫組化檢測，17例陰性(-)或弱陽性(+)，10例陽性(++)或強(qiáng)陽性(+++)。TCRP1(-)和(+)組對(duì)化療敏感者達(dá)94.2％，TCRP1(++)和(+++)組對(duì)化療敏感者為20.0％，兩組相比有顯著性差異(p<0.05)。提示TCRP1免疫組化檢測結(jié)果與體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果有相關(guān)性。
　　

9、(3)成功建立裸鼠移植瘤模型；相對(duì)于生理鹽水處理組，5-Fu組的裸鼠移植瘤在藥物作用下均表現(xiàn)明顯的生長抑制；cDDP組，TCRP1高表達(dá)的細(xì)胞組腫瘤生長仍然保持較快的生長速度，反之，TCRP1表達(dá)水平低的細(xì)胞組則表現(xiàn)較為明顯的生長抑制效應(yīng)，提示 TCRP1的表達(dá)與裸鼠移植瘤的cDDP敏感性相關(guān)。TUNEL法檢測結(jié)果顯示，裸鼠移植瘤組織內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)隨TCRP1表達(dá)下調(diào)而明顯增加。
　　 (4)放療后克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：過表達(dá)細(xì)胞

10、株Tca8113/TCRP1及對(duì)照細(xì)胞株的2Gy的生存分?jǐn)?shù)(SF2)分別為0.69±0.04和0.35±0.05。Tca8113/PYM/siRNA及對(duì)照組的SF2分別為0.43±0.01和0.78±0.07，組間比較差異均有顯著性(p<0.05)。彗星實(shí)驗(yàn)檢測4Gy的放射線照射后DNA損傷情況，放射線照射24小時(shí)后，與對(duì)照組相比，在TCRP1低表達(dá)的細(xì)胞株中，可見明顯的DNA拖尾現(xiàn)象。尾距明顯較高。Komet5.5 software軟

11、件分析圖形并統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后顯示組間差異有顯著性(p<0.05)。Hoechst33258凋亡細(xì)胞染色發(fā)現(xiàn)4Gy的放射線照射后，TCRP1高表達(dá)的細(xì)胞株凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯少于TCRP1表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞株。同時(shí)，Western blot檢測舌癌細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示凋亡相關(guān)蛋白caspase-3，caspase-8及caspase-9基礎(chǔ)表達(dá)在TCRP1低表達(dá)細(xì)胞中明顯增高，相反，抗凋亡蛋白Bcl-2則在 TCRP1高表達(dá)細(xì)胞株中表達(dá)

12、升高。
　　 (5)HPLC法檢測結(jié)果顯示在不同的細(xì)胞株中，順鉑蓄積濃度沒有明顯差異。Western結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Akt，p-Akt，NF-κB，MT-Ⅰ及抗凋亡蛋白bcl-2，隨TCRP1表達(dá)下調(diào)而下調(diào)。進(jìn)一步的免疫共沉淀證實(shí)了TCRP1與Akt存在物理上的相互作用。Western證實(shí) TCRP1對(duì)MT-Ⅰ可能存在正向調(diào)控作用。
　　 (6)免疫組化檢測口腔鱗癌組織芯片顯示：Akt及MT-Ⅰ的表達(dá)與TCRP1表達(dá)呈正相關(guān)。

13、
　　 結(jié)論：
　　 (1)TCRP1能預(yù)測口腔鱗癌對(duì)順鉑化療和放療的敏感性，可能是一個(gè)新的化、放療耐受標(biāo)志物；
　　 (2)TCRP1可能通過增加口腔鱗癌對(duì)順鉑誘導(dǎo)的凋亡抗性而介導(dǎo)順鉑耐受；
　　 (3)TCRP1介導(dǎo)OSCC對(duì)放療耐受作用可能與增加放射線誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)有關(guān)。
　　 (4)TCRP1主要定位于胞核和胞漿，TCRP1不改變細(xì)胞內(nèi)順鉑的蓄積濃度，其作用與“藥泵”功能無關(guān)；