大腸桿菌f2噬菌體分子印跡膜的制備、評(píng)價(jià)和應(yīng)用.pdf

1、水中微生物污染是影響水質(zhì)的重要因素之一，其中腸道病毒是水中廣泛存在的微生物，當(dāng)前在水處理中最常使用的氯、臭氧和紫外線等多種消毒方法均無法保證對(duì)病毒的有效去除。由于飼養(yǎng)生吃海貝的水域被含人腸道病毒（如小型球狀病毒）污水污染造成食物中毒的情況在日本頻繁發(fā)生，更說明目前廣泛使用的污水處理方法無法有效去除病毒的污染。為此，發(fā)達(dá)國(guó)家在飲用水、娛樂用水和地下水標(biāo)準(zhǔn)中都引入了腸道病毒指標(biāo)。我國(guó)目前還未將病毒指標(biāo)列入水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中，但隨著自然界中動(dòng)物病毒對(duì)

2、人類健康危險(xiǎn)性的增加，越來越要求加強(qiáng)對(duì)水中病毒的檢測(cè)，以確保水質(zhì)安全。
　　 水中病毒含量低且需要在敏感細(xì)胞內(nèi)才能自我復(fù)制，目前水中病毒檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法一般包括分離、濃縮富集、增殖、檢測(cè)四個(gè)步驟。首先需要對(duì)水樣預(yù)處理，調(diào)節(jié)水樣的pH，然后用非特異性的正離子或負(fù)離子吸附柱，吸附水中帶電荷的病毒，用洗脫液將吸附的病毒等物質(zhì)洗脫下來，調(diào)節(jié)洗脫液pH，通過絮凝沉淀的方法分離出洗脫液中的病毒，再用小體積緩沖液重新溶解沉淀的病毒，然后用微孔濾

3、膜過濾除去細(xì)菌，得到含病毒的水樣濃縮液。將濃縮液加入敏感細(xì)胞中，培養(yǎng)一定時(shí)間（一般為1-3天）后，通過計(jì)算病毒在培養(yǎng)的敏感細(xì)胞中增殖所產(chǎn)生的噬菌斑形成單位（Plaque forming unit，PFU）等方法確定病毒滴度。由于吸附和濃縮方法缺乏特異性，因此水樣濃縮液中存在許多與病毒帶相同電荷的微生物如細(xì)菌、真菌等，需要通過培養(yǎng)，將可形成噬菌斑的病毒與其它微生物分開。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chai

4、n reaction，PCR）和免疫熒光等方法陸續(xù)用于病毒檢測(cè)。分子生物學(xué)方法可以檢測(cè)低濃度的病毒，縮短增殖和檢測(cè)時(shí)間，但仍需要費(fèi)時(shí)復(fù)雜的病毒分離和富集過程。因此，盡管目前病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)方法發(fā)展迅速，但受病毒分離和富集等前處理方法的限制，仍無法快速測(cè)定水中的各種病毒，迫切需要可特異性高效分離和富集水中病毒的新方法。
　　 靜電紡絲（電紡）是將電紡聚合物溶液在高壓電場(chǎng)中受到庫倫斥力、靜電推力和液面表面張力三者之間的相互作用，

5、在適宜的條件下可先是在噴絲口形成泰勒錐，突破臨界電壓后再以射流的形式分離。射流不斷被靜電場(chǎng)牽引拉伸，最后溶劑揮發(fā)，形成干燥固化的納米纖維絲狀物落在負(fù)極上。目前已有相關(guān)研究利用電紡將微生物（包括細(xì)菌、病毒和細(xì)胞）固定在電紡纖維上。據(jù)此，我們?cè)O(shè)想，利用電紡法將病毒固定到電紡纖維上后，洗脫纖維上的模板分子，即可在電紡膜上形成擁有特定的病毒空間結(jié)構(gòu)的分子印跡聚合物，從而可以特異性吸附水中的靶病毒。因此，含有特定病毒空間結(jié)構(gòu)的電紡膜可以作為大腸桿

6、菌f2噬菌體分子印跡膜，特異性分離和富集水中痕量的靶病毒。
　　 由于水中微生物數(shù)量和種類繁多，往往無法做到對(duì)每一種微生物均進(jìn)行檢測(cè)，為此，對(duì)水中微生物的檢測(cè)一般采用指示生物，如目前水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中采用總大腸桿菌菌群和糞大腸菌群作為腸道細(xì)菌的指示菌。腸道病毒與腸道細(xì)菌情況類似，也需要采用合適的指示病毒。大腸桿菌噬菌體作為細(xì)菌病毒，在污水中普遍存在且數(shù)量高于腸道病毒，對(duì)自然條件及水處理過程的抗性高于細(xì)菌，接近動(dòng)物病毒，對(duì)人沒有致病性。國(guó)

7、際標(biāo)準(zhǔn)化組織和美國(guó)環(huán)境保護(hù)總署均提出用大腸桿菌噬菌體作為腸道病毒指示生物。其中F+RNA噬菌體在性質(zhì)上最接近腸道病毒，適宜作為腸道病毒的指示物。F+RNA噬菌體對(duì)人無害，已大量用于水的病毒學(xué)安全評(píng)價(jià)、污染源追蹤、污水處理效率分析等多種研究中。大腸桿菌f2噬菌體是水中常見的F+RNA噬菌體，本研究將以f2噬菌體作為靶病毒，利用靜電紡絲技術(shù)，在水溶性和生物兼容性較好的聚乙烯醇（Poly vinyl alcohol，PVA）納米纖維上制備f2

8、噬菌體分子印跡膜，并對(duì)其吸附特性和實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行研究。
　　 本研究整體分為三個(gè)部分：
　　 第一部分、大腸桿菌f2噬菌體的擴(kuò)增純化
　　 目的：制備高效價(jià)的大腸桿菌f2噬菌體。
　　 方法：以大腸桿菌285為宿主菌，用營(yíng)養(yǎng)肉湯擴(kuò)增噬菌體f2。以聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）沉淀-氯仿抽提方法純化擴(kuò)增的噬菌體，并用雙層瓊脂平板法檢測(cè)噬菌體的效價(jià)。
　　 結(jié)果：大腸桿菌f2

9、 噬菌體擴(kuò)增后的效價(jià)達(dá)到2.45×1010pfu/mL，經(jīng)PEG沉淀-氯仿抽提方法純化后效價(jià)提高4個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到6.55×1014pfu/mL左右。
　　 結(jié)論：聚乙二醇沉淀-氯仿抽提方法可用于制備高純度f2噬菌體。
　　 第二部分、電紡法制備大腸桿菌f2噬菌體分子印跡膜及其評(píng)價(jià)
　　 目的：評(píng)價(jià)所制備的大腸桿菌f2噬菌體分子印跡膜的吸附特性。
　　 方法：利用掃描電鏡測(cè)定不同靜電紡絲條件下所制備的大腸桿

10、菌f2噬菌體分子印跡膜的形態(tài)，靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定f2噬菌體分子印跡膜的吸附容量和吸附特異性，篩選出最優(yōu)的電紡條件。測(cè)定各種洗脫液對(duì)靶噬菌體的吸附回收率，探索效果最好的洗脫液。
　　 結(jié)果：①不同的電紡條件對(duì)電紡纖維形態(tài)和電紡速度有明顯影響，最佳的電紡條件為：0.5gPVA，5mL純水，3mL甲醇溶液和2mLSM溶液。噴絲口針頭到收集器之間的接收距離為15.7cm，電壓15-18kv。在最佳電紡條件下得到的纖維，勻纖細(xì)，表面光滑，無

11、珠狀纖維和滴液，平均直徑在300nm左右，電紡速度為1mL/2h。②經(jīng)過測(cè)試，電紡溶液中的甲醇等溶液對(duì)噬箘體的活性影響不大，與噬箘體原液相比，僅降低了約5％噬菌體效價(jià)。③ 10％十二烷基硫酸鈉-10％乙酸溶液在超聲的輔助下洗脫模板分子后的電紡膜吸附率可以達(dá)到82.19％，相對(duì)超聲與振蕩聯(lián)合，以及單獨(dú)振蕩洗脫方式，在同等環(huán)境下的膜吸附效果最好。④靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)以吸附率（吸附的噬菌體/吸附前的噬菌體）表示。結(jié)果顯示，4℃下，隨著噬菌體濃

12、度的增加，大腸桿菌f2分子印跡膜（MIP）吸附率從60％（104pfu/mL）增加到79％（108pfu/mL），對(duì)照組的非分子印跡聚合物（Non-molecule imprint polymers，NIP）相應(yīng)地從20％到50％。37℃下，MIP從71.43％（103pfu/mL）到的83.44％（1012pfu/mL），NIP相應(yīng)地從53.57％到65.63％。37℃時(shí)，f2噬菌體印跡膜對(duì)結(jié)構(gòu)不同的另外兩種大腸桿菌M13、285P噬

13、菌體的吸附率分別為60％和53.97％，NIP分別為57.33％和63.97％。顯示MIP在37℃可有效識(shí)別和分離靶f2噬菌體，但存在一定的非特異性識(shí)別。⑤ SM緩沖液作為洗脫液，f2噬菌體印跡膜的回收率（79％）遠(yuǎn)大于營(yíng)養(yǎng)肉湯（50％）或3％牛肉膏-0.05M甘氨酸洗脫液（48％）。
　　 結(jié)論：①電紡溶液的組成、模板分子的含量、噴絲口針頭的大小以及有機(jī)溶劑的添加等電紡參數(shù)，對(duì)電紡可紡性以及運(yùn)行過程中紡絲狀況都有很大的影響。不

14、論是聚合物的質(zhì)量、針頭型號(hào)、電壓還是接收距離都存在一個(gè)可紡范圍。有機(jī)溶劑的加入可以有效抑制電紡過程中滴液的狀況，保持電紡成絲的穩(wěn)定性。②電紡溶液雖然含有一定量的甲醇，但對(duì)噬菌體活性影響不大，相對(duì)而言，電紡對(duì)噬菌體損傷較大。③洗脫噬菌體后的電紡纖維膜，可特異性識(shí)別、結(jié)合并有效吸附靶噬菌體。MIP對(duì)模板分子f2噬菌體的吸附量高于NIP，對(duì)另外兩種大腸桿菌DNA噬菌體的吸附與NIP類似，顯示MIP對(duì)靶噬菌體具有很高的特異性吸附力。MIP對(duì)f2

15、噬菌體的吸附率隨著初始投入的噬菌體濃度增加而上升。溫度升高，布朗運(yùn)動(dòng)活躍，使得37℃下的噬菌體吸附效果好于4℃。④對(duì)比其它洗脫液，SM緩沖溶液的回收效率最高。
　　 第三部分、大腸桿菌f2噬菌體分子印跡膜的初步應(yīng)用
　　 目的：評(píng)價(jià)大腸桿菌f2噬菌體分子印跡膜在自然水體中對(duì)大腸桿菌噬菌體f2的吸附效果。
　　 方法：取湖水和池塘水，用1mol/L的HCl將實(shí)際水樣pH降至3.5后，加入一定濃度的f2噬菌體后，分別

16、利用f2噬菌體分子印跡膜和商品化的硝酸纖維濾膜（0.22μm）吸附水中噬菌體后，測(cè)定各種膜對(duì)靶噬菌體的加標(biāo)回收率。
　　 結(jié)果：兩種環(huán)境水樣中（湖水和池塘水）均未檢測(cè)到大腸桿菌f2 噬菌體。對(duì)加標(biāo)水樣的測(cè)定結(jié)果顯示，MIP對(duì)校內(nèi)池塘和北湖中f2噬菌體的加標(biāo)吸附率分別為74.80％和68.94％；NIP膜分別為51.50％和41.85％；硝酸纖維濾膜分別為52.45％和43.73％。
　　 結(jié)論：MIP可特異性分離和富集自

17、然水體中的f2噬菌體，效果優(yōu)于文獻(xiàn)中報(bào)道的硝酸纖維濾膜方法，但回收率稍低于純水中的回收率。由電紡制備的大腸桿菌f2噬菌體分子印跡膜適合用于分離和富集實(shí)際水樣中噬菌體。
　　 本論文的結(jié)論和創(chuàng)新點(diǎn)：
　　 1．主要結(jié)論
　　 (1)本研究建立了大腸桿菌f2噬菌體的擴(kuò)增、培養(yǎng)、純化、濃縮和測(cè)定的系列操作方法，制備出純度較高的噬菌體，并利用雙層瓊脂培養(yǎng)法檢測(cè)樣品中噬菌體的含量。
　　 (2)應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)，成

18、功制備大腸桿菌f2噬菌體的分子印跡纖維膜。靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)顯示電紡法所制備的大腸桿菌f2噬菌體分子印跡膜可特異性分離和結(jié)合靶噬菌體。
　　 (3)電紡法制備的大腸桿菌f2噬菌體分子印跡膜可特異性分離和富集實(shí)際水樣中的f2噬菌體，回收率優(yōu)于非特異性的商品化硝酸纖維濾膜。
　　 2．創(chuàng)新點(diǎn)
　　 (1)用靜電紡絲制備f2噬菌體分子印跡膜。
　　 (2)靜電紡絲法所制備的f2噬菌體分子印跡膜具有較高的印跡效果，可特