大腸桿菌噬菌體IME-EC1耐受菌的篩選及耐受機制研究.pdf

1、隨著抗生素的廣泛使用,耐藥性細菌的產(chǎn)生開始引起全世界的廣泛關注。這使得人們開始重新考慮利用噬菌體治療細菌感染,即噬菌體治療。噬菌體是細菌的天然殺手,能夠與抗生素聯(lián)合使用治療耐藥性細菌引起的感染,是解決抗生素耐藥性問題的最佳選擇之一。在噬菌體治療過程中,細菌往往會對噬菌體產(chǎn)生耐受,導致耐受噬菌體的菌株出現(xiàn),從而影響噬菌體治療效果。細菌對來自噬菌體的攻擊已進化了多種防御機制,如抑制吸附、流產(chǎn)感染系統(tǒng)(abortive infection s

2、ystem)、限制-修飾系統(tǒng)、CRISPR系統(tǒng)等。噬菌體在抵御細菌的防御機制的同時也進化了相應的策略來逃避宿主的防御,噬菌體和細菌在相互作用的過程中共同進化。
　　規(guī)律成簇的間隔短回文重復(Clustered regμlarly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)存在于40％細菌和90%古細菌基因組中,由重復序列(direct repeat,DR)和長度相似的非重復的間區(qū)序列

3、(spacer)間隔排列組成一個單元形成 CRISPR簇,是細菌內存在的專門針對噬菌體及質粒等外源基因的獲得性免疫系統(tǒng),這種抗性作用的發(fā)揮類似于真核生物中的RNA干擾作用。CRISPR對于細菌產(chǎn)生對噬菌體的耐受具有重要的影響。
　　本課題擬研究大腸桿菌耐受噬菌體的作用機制,尤其是CRISPR系統(tǒng)與細菌耐受噬菌體之間的相互關系。為開展這項工作,我們通過PCR方法篩選含有CRISPR系統(tǒng)的大腸桿菌,分析這些大腸桿菌 CRISPR系統(tǒng)的

4、特征。然后以含有 CRISPR系統(tǒng)的大腸桿菌為指示菌,從醫(yī)院污水中分離相關的噬菌體,進而篩選出耐受噬菌體的大腸桿菌突變株。完成敏感菌和耐受菌的全基因組測序,對兩株細菌基因組序列比較分析,尋找耐受菌中是否有單堿基突變、序列插入、缺失等,研究噬菌體耐受菌對噬菌體產(chǎn)生耐受的機制。
　　根據(jù)CRISPR database數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公布的大腸桿菌的CRISPR序列的信息,我們設計了4對特異性的引物,采用 PCR的方法檢測到42株大腸桿菌中

5、含有CRISPR序列,并對所擴增的CRISPR序列的特征進行了分析。結果表明,在大腸桿菌CRISPR序列中,DR序列基本一致,spacer序列則具有多態(tài)性。然后選用其中一株大腸桿菌 E.coli147-30作為指示菌,自醫(yī)院污水中分離得到了一株噬菌體IME-EC1,在噬菌體的選擇壓力下,篩選得到了噬菌體 IME-EC1的耐受菌E.coli147-30R,在此基礎上又分離得到其可裂解耐受菌E.coli147-30R的噬菌體IME-EC2,

6、實驗發(fā)現(xiàn),IME-EC2不能裂解E.coli147-30。在耐受菌的CRISPR序列中,發(fā)現(xiàn)沒有新的間隔序列的插入,推測大腸桿菌耐受菌E.coli147-30R對噬菌體IME-EC1的抗性不是由于間隔序列的插入而導致的。為進一步分析耐受產(chǎn)生的機制,我們對IME-EC1敏感菌E.coli147-30和耐受菌E.coli147-30R進行了全基因組測序,通過全基因組序列比較分析,發(fā)現(xiàn)耐受菌中存在序列的插入、缺失現(xiàn)象。其中最大的一處差異是由于