黃芪甲苷對(duì)高胰島素誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　在體外，觀察不同濃度胰島素（insulin，INS）對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞（human mesangial cells,HMCs）細(xì)胞增殖的影響，研究黃芪甲苷（astragalosides IV,As-IV）對(duì)高胰島素環(huán)境中HMCs的損傷是否具有保護(hù)作用，探討高胰島素對(duì)糖尿病腎病（diabetic nephropathy,DN）發(fā)生發(fā)展與As-IV防治HMCs損傷的可能作用機(jī)制，從而為臨床上防治DN及As-IV的應(yīng)用提供依

2、據(jù)。
　　方法：
　　1.將常規(guī)復(fù)蘇的HMCs用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于含5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.將HMCs隨機(jī)分組如下：（1）正常組（NG）、胰島素組（INS，分別含1，2，4，8，16，32，64，128 nmol/L胰島素）；（2）正常組（NG）、高胰島素（HINS，64 nmol/L）組、DPI（10μmol/L）組、Tem

3、pol（100μmol/L）組、LY294002（10μmol/L）組與As-IV（6.25，12.5，25，50，100μmol/L）組；（3）正常組（NG）、高胰島素（HINS，64 nmol/L）組、Tempol（100μmol/L）組、LY294002（10μmol/L）組與As-IV（25，50，100μmol/L）組；（4）正常組（NG）、高胰島素（HINS，64 nmol/L）組、DPI（10μmol/L）組、Tempol

4、（100μmol/L）組、LY294002（10μmol/L）組與As-IV（25，50，100μmol/L）組；（5）正常組（NG）、高胰島素（HINS，64 nmol/L）組、DPI（10μmol/L）組、LY294002（10μmol/L）組與As-IV（25，50，100μmol/L）組，分別進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作。
　　3. MTT比色法檢測(cè)2（1）分組中不同濃度INS作用不同時(shí)間后對(duì)HMCs細(xì)胞增殖的影響，根據(jù)結(jié)果，篩選IN

5、S的最佳作用濃度和時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按2（2）分組，仍采用MTT比色法，檢測(cè)各用藥組對(duì)高胰島素誘導(dǎo)的HMCs細(xì)胞增殖的作用情況，同時(shí)篩選As-IV的最佳用藥濃度。
　　4.采用ELISA法檢測(cè)2（3）分組中各組細(xì)胞上清液中纖維連結(jié)蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix met

6、alloproteinase-9，MMP-9）的含量。同時(shí)采用二氫二氯熒光素（DCFH-DA）法檢測(cè)2（4）分組中各組細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量；Western blot法分別檢測(cè)2（5）分組中NADPH氧化酶4（NADPH oxidase4，NOX4）和2（3）分組中磷酸化蛋白激酶B（phosphor-protein kinase b，p-PKB，又稱p-Akt）、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素

7、靶蛋白（phosphor-mammalian target of rapamycin，p-mTOR）蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:
　　1. MTT結(jié)果顯示，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加，INS對(duì) HMCs的促增殖作用不斷增強(qiáng)，具有時(shí)效與量效關(guān)系；與正常組比較，高胰島素組細(xì)胞增殖顯著增加（P＜0.01），與高胰島素組比較，DPI、Tempol、LY294002及As-IV（6.25，12.5，25，50，100μmol/L）

8、組對(duì)高胰島素誘導(dǎo)的HMCs細(xì)胞增殖均有不同程度的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01）。且As-IV對(duì) HMCs的抑制作用隨著用藥濃度的增加不斷增強(qiáng)，其中，As-IV（25，50，100μmol/L）組的抑制作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。
　　2. ELISA結(jié)果顯示，與正常組比較，高胰島素組HMCs細(xì)胞上清液中FN、MMP-9、TIMP-1含量上升，MMP-9/TIMP-1比值下降（P＜0.01）。與高胰島素組

9、比較，Tempol、LY294002及As-IV（25，50，100μmol/L）組均能改善高胰島素誘導(dǎo)的FN、MMP-9、TIMP-1的異常分泌（P＜0.05，P＜0.01），且As-IV對(duì)以上三種蛋白分泌及MMP-9/TIMP-1比值的影響呈濃度依賴性，表明As-IV在調(diào)控INS對(duì)體外培養(yǎng)的 HMCs的細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，且在一定范圍內(nèi)呈時(shí)間和濃度依賴性；而As-IV對(duì)高胰島素誘導(dǎo)的HMCs損傷具有保護(hù)作用，且在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)呈濃度依

10、賴性，其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制可能與As-IV具有抑制細(xì)胞增殖、NOX4蛋白表達(dá)和Akt、mTOR蛋白磷酸化，改善FN、MMP-9、TIMP-1的異常分泌，緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的功能有關(guān)。
　　結(jié)論:INS對(duì)體外培養(yǎng)的HMCs的細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，且在一定范圍內(nèi)呈時(shí)間和濃度依賴性；而As-IV對(duì)高胰島素誘導(dǎo)的HMCs損傷具有保護(hù)作用，且在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)呈濃度依賴性，其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制可能與As-IV具有抑制細(xì)胞增殖、NOX4蛋白表達(dá)和