黃芪甲苷對(duì)高胰島素致腎損傷的影響及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：黃芪對(duì)高胰島素血癥致早期2型糖尿病患者腎損傷的影響
　　目的：評(píng)價(jià)黃芪（astragalus）對(duì)高胰島素血癥（hyperinsulinemia，HINS）致早期2型糖尿病患者腎損傷的影響。
　　方法：早期2型糖尿病患者68例，采用多次皮下注射胰島素（Multiple subcutaneous insulin injection，MDI)的方式，給予強(qiáng)化血糖治療。強(qiáng)化治療的標(biāo)準(zhǔn)為空腹血糖（FPG）<7.0 mmoL/

2、L，餐后兩小時(shí)血糖（2 hPG）<10.0 mmoL/L。所有患者血糖達(dá)標(biāo)后，繼續(xù)強(qiáng)化治療3周，查患者空腹胰島素（fasting insulin, FINS）水平≥15mU/L，即符合高胰島素血癥的診斷。將這些達(dá)到診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者隨機(jī)分成兩組，即黃芪顆粒組（AG組）和高胰島素血癥組（HINS組），每組20例，于分組后次日清晨（黃芪顆粒干預(yù)前，T0時(shí)間點(diǎn)）抽血檢查空腹血糖(FPG)、餐后兩小時(shí)血糖（2hPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、丙

3、氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、血肌酐（CREA）、血尿素氮（BUN）、視黃醇結(jié)合蛋白（RBP）、胱抑素C（Cys-C）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）。留晨尿檢測(cè)尿微量白蛋白（Ualb）。AG組患者在每天胰島素強(qiáng)化治療的基礎(chǔ)上，服用黃芪顆粒，用法是每次4g，每天兩次；HINS組患者繼續(xù)進(jìn)行胰島素強(qiáng)化治療，不加任何其他藥物。兩組患

4、者均繼續(xù)強(qiáng)化治療9周。未達(dá)到高胰島素血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的28例患者可以自行選擇繼續(xù)治療的方式，不再列入實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行干預(yù)。AG組和HINS組于強(qiáng)化治療結(jié)束后（黃芪顆粒干預(yù)后，T1時(shí)間點(diǎn)）抽血復(fù)查T(mén)0時(shí)間點(diǎn)的所有指標(biāo)。
　　結(jié)果：在T1時(shí)間點(diǎn)，與HINS組比較，AG組RBP、Cys-C、Ualb、MDA值均小于HINS組，而GSH-PX、SOD值均大于HINS組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩組患者的FPG、2hPG在各自的組內(nèi)，從T0

5、到T1，有升高趨勢(shì)，而HbA1c有下降趨勢(shì)（P<0.05）；在HINS組內(nèi)，從T0到T1，RBP、Cys-C、Ualb、MDA有升高趨勢(shì)，而GSH-PX、SOD有下降趨勢(shì)（P<0.05）。
　　結(jié)論：對(duì)早期2型糖尿病患者使用胰島素進(jìn)行強(qiáng)化治療，血糖達(dá)標(biāo)后，繼續(xù)治療超過(guò)3周，患者可以出現(xiàn)高胰島素血癥，這種高胰島素血癥持續(xù)9周以上，可以對(duì)腎臟有輕微的損傷作用，具體表現(xiàn)在可以使得RBP、Cys-C、Ualb等指標(biāo)升高；也使得體內(nèi)氧化應(yīng)激

6、水平增高，具體表現(xiàn)在MDA升高，GSH-PX、SOD降低。黃芪顆粒能夠阻止高胰島素血癥下的RBP、Cys-C、Ualb水平的升高，還能夠阻止高胰島素血癥下體內(nèi)的氧化應(yīng)激的增強(qiáng)，對(duì)腎臟有保護(hù)作用。
　　第二部分：黃芪甲苷對(duì)高胰島素血癥致實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠腎損傷的影響及機(jī)制研究
　　目的：在建立的高胰島素血癥的糖尿病大鼠模型上，研究AS-Ⅳ對(duì)高胰島素血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷的影響，分析AS-Ⅳ保護(hù)腎臟作用的可能機(jī)制。
　　方法：成

7、功建立實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠模型（腹腔注射STZ55 mg/kg)，一周以后，采用皮下注射地特胰島素（6U/day）的方式控制血糖，一直持續(xù)4周。4周后測(cè)量大鼠清晨的胰島素水平，當(dāng)INS>30μU/ml,認(rèn)為高胰島素血癥大鼠模型成功建立。符合高胰島素血癥診斷的大鼠隨機(jī)被分成5組，即高胰島素血癥組（HINS）、AS-Ⅳ（2.5、5和10 mg/kg/day，ig）組和Tempol（60mg/kg/day, ig）組；正常組（Control）作為

8、空白對(duì)照。除了正常組外，所有的高胰島素血癥大鼠繼續(xù)維持胰島素治療12周。血糖每隔1、2或4周測(cè)量一次，在第12周周末，檢測(cè)HbA1c、血清INS、CREA、BUN、ALT、AST、TG和TC。采用代謝籠法，在第4周、8周、12周周末收集24h尿液，測(cè)量24h尿白蛋白排泄率。檢測(cè)腎臟上極組織的MDA、GSH-Px、SOD、IL-1β、TNF-α和COl-Ⅳ。使用HE、PAS染色觀察常規(guī)腎臟病理切片；使用透射電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)。使用We

9、stern blot的方法，檢測(cè)Nox4、pERK1/2和TRPC6的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.與正常組比較，HINS組大鼠尿蛋白排泄率較高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。AS-Ⅳ可以在一定程度上減輕白蛋白尿的癥狀。
　　2.與正常組比較，HINS組MDA水平增加，GSH-Px和SOD水平降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。AS-Ⅳ可以明顯減少M(fèi)DA，增加GSH-Px和SOD。
　　3.與正常組比較，HIN

10、S組IL-1β和TNF-α水平增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。AS-Ⅳ可以明顯減少I(mǎi)L-1β和TNF-α。
　　4.與正常組比較，HINS組 Col-Ⅳ和 LN水平增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。AS-Ⅳ可以明顯減少Col-Ⅳ和LN。
　　5.與正常組比較，HINS組出現(xiàn)輕度的腎小球系膜細(xì)胞增生，AS-Ⅳ可以阻止腎小球系膜細(xì)胞的增生。
　　6.與正常組比較，HINS組腎小球基底膜增厚，足突細(xì)胞有少量融合，AS-

11、Ⅳ可以阻止腎小球基底膜增厚以及足突細(xì)胞融合。
　　7.與正常組比較，HINS組Nox4蛋白，pERK1/2蛋白水平增加，TRPC6蛋白水平降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。AS-Ⅳ可以明顯抑制Nox4和pERK1/2蛋白的表達(dá)，而增加TRPC6蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1. STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠經(jīng)過(guò)胰島素強(qiáng)化治療4周，可以出現(xiàn)高胰島素血癥，這種狀態(tài)持續(xù)12周可以對(duì)腎臟造成損傷。
　　2. AS-Ⅳ對(duì)高胰島

12、素血癥對(duì)大鼠腎臟的損傷具有保護(hù)作用，其可能與抑制氧化應(yīng)激、促炎癥因子生成，下調(diào)Nox4和pERK1/2蛋白的表達(dá)，增加TRPC6蛋白的表達(dá)有關(guān)。
　　第三部分：高胰島素致人腎小球系膜細(xì)胞損傷的機(jī)制研究及黃芪甲苷的干預(yù)作用
　　目的：
　　研究NADPH氧化酶/ROS/ERK信號(hào)通路在高胰島素致MCs損傷中的作用，探討黃芪甲苷對(duì)此通路的干預(yù)調(diào)控及對(duì)高胰島素致MCs損傷的影響。
　　方法：
　　1.將常規(guī)培養(yǎng)的

13、MCs細(xì)胞分為以下6組：NG（5.6 mM葡萄糖）組，胰島素（12.5、25、50、100、200 nM）組。將MCs分別孵育12h、24h、36h、48h、72h后，使用MTT的方法，檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況。
　　2.將常規(guī)培養(yǎng)的MCs分為以下5組：（1）NG，（2）HINS（100nM）12h，（3） HINS（100nM）24h，（4）HINS（100nM）36h，（5）HINS（100nM）48h。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

14、檢測(cè)Nox4 mRNA和TRPC6 mRNA的表達(dá)；采用Western blot法檢測(cè)Nox4蛋白和TRPC6蛋白的表達(dá)。
　　3.將常規(guī)培養(yǎng)的MCs分為以下6組：（1）NG，（2）HINS（100nM）0.5h，（3） HINS（100nM）1h，（4）HINS（100nM）3h，（5）HINS（100nM）24h，（6） HINS（100nM）48h。分別給予高胰島素培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間，HINS分別刺激0.5h、1h、3h、24h

15、、48h，采用Western blot法檢測(cè)相應(yīng)時(shí)間MCs中ERK1/2蛋白的磷酸化水平。
　　4.將常規(guī)培養(yǎng)的MCs細(xì)胞分為以下7組：（1）NG組，（2）NG+DPI（10μM）組，（3）NG+Tempol（100μM）組，（4）HINS（100nM）組，（5）HINS（100nM）+DPI（10μM）組，（6）HINS（100nM）+Tempol（100μM）組，（7）HINS（100nM）+U0126（10μM）組。分別給藥

16、48h后，采用MTT法對(duì)各組細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行檢測(cè)。
　　5.將常規(guī)培養(yǎng)的MCs細(xì)胞分為以下8組：（1）NG組，（2）NG+DPI（10μM）組，（3）NG+Tempol（100μM）組，（4）NG+U0126（10μM）組，（5）HINS（100nM）組，（6）HINS（100nM）+Tempol（100μM）組，（7）HINS（100nM）+DPI（10μM）組，（8）HINS（100nM）+U0126（10μM）組。分別給藥

17、48h后，采用DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)各組細(xì)胞的ROS水平。
　　6.將常規(guī)培養(yǎng)的MCs分為以下5組：（1）NG組，（2）HINS（100nM）組，（3） HINS（100nM）+U012610μM組，（4）HINS（100nM）+DPI10μM組，（5） HINS（100nM）+Tempol100μM組。分別給藥48h后，采用光度法檢測(cè)各組細(xì)胞NADPH氧化酶活性，采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞的Nox4蛋白、T

18、RPC6蛋白的表達(dá)情況以及ERK1/2蛋白的磷酸化水平。
　　7.將常規(guī)培養(yǎng)的MCs細(xì)胞分為以下5組：（1）NG組，（2）HINS(100nM)組，（3）HINS(100nM)+AS-Ⅳ25μM組，（4）HINS(100nM)+AS-Ⅳ50μM組，（5）HINS(100nM)+AS-Ⅳ100μM組。48h后，采用MTT法分別檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況。
　　8.將常規(guī)培養(yǎng)的MCs分為以下6組：（1）NG組，（2）HINS(100

19、nM)組，（3）HINS(100nM)+AS-Ⅳ25μM組，（4）HINS(100nM)+AS-Ⅳ50μM組，（5）HINS(100nM)+AS-Ⅳ100μM組，（6）HINS(100nM)+Tempol100μM組，分別給藥48h后，采用DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)各組細(xì)胞ROS水平。
　　9.將常規(guī)培養(yǎng)的MCs分為以下6組：（1）NG組，（2）HINS(100nM)組，（3）HINS(100nM)+ AS-Ⅳ25μM組，（4）

20、HINS(100nM)+ AS-Ⅳ50μM組，（5） HINS(100nM)+AS-Ⅳ100μM組，（6）HINS(100nM)+OAG100μM組。給藥48h后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)各組細(xì)胞的TRPC6 mRNA的表達(dá)水平，采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)各組細(xì)胞的TRPC6蛋白的表達(dá)水平。
　　10.將常規(guī)培養(yǎng)的 MCs分為以下6組：（1）NG組，（2）HINS(100nM)組，（3） HINS(100nM)

21、+ AS-Ⅳ25μM組，（4）HINS(100nM)+ AS-Ⅳ50μM組，（5） HINS(100nM)+AS-Ⅳ100μM組，（6）HINS(100nM)+DPI10μM組。分別給藥48h后，采用光度法檢測(cè)各組細(xì)胞NADPH氧化酶活性，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞的Nox4 mRNA的表達(dá)水平，采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞的Nox4蛋白的表達(dá)水平。
　　11.將常規(guī)培養(yǎng)的 MCs分為以下6組：（1）NG組

22、，（2）HINS(100nM)組，（3） HINS(100nM)+AS-Ⅳ25μM組，（4）HINS(100nM)+AS-Ⅳ50μM組，（5） HINS(100nM)+AS-Ⅳ100μM組，（6）HINS(100nM)+U012610μM組。給藥48h后，采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平。
　　結(jié)果：
　　1.高濃度胰島素培養(yǎng)一定時(shí)間后，MCs的增殖顯著升高，并可促進(jìn)ROS的生成。高胰島

23、素促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖的作用能夠被NADPH氧化酶抑制劑、ROS抑制劑和ERK通路抑制劑抑制。
　　2.高濃度胰島素培養(yǎng)一定時(shí)間后，MCs中Nox4 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。使用特異性信號(hào)分子抑制劑后，高胰島素環(huán)境下MCs內(nèi)Nox4蛋白和ROS的生成均顯著降低，提示高胰島素促系膜細(xì)胞增殖作用可能是通過(guò)上調(diào) Nox4亞基的表達(dá)，從而促進(jìn)ROS生成來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　3.高濃度胰島素培養(yǎng)一定時(shí)間后，MCs中ERK1/2蛋白的磷酸

24、化水平顯著上調(diào)，激活ERK信號(hào)通路。NADPH氧化酶抑制劑和ROS抑制劑均能顯著抑制高胰島素環(huán)境下MCs中ERK1/2蛋白的磷酸化，提示高胰島素對(duì)MCs中ERK信號(hào)通路的調(diào)控作用與NADPH氧化酶性ROS具有密切的相關(guān)性。ERK通路被抑制時(shí)，對(duì)高胰島素環(huán)境下MCs中Nox4蛋白表達(dá)水平以及ROS水平均沒(méi)有明顯影響，僅能抑制細(xì)胞異常增殖。提示在上述信號(hào)通路中 ERK1/2活化處于NADPH氧化酶性ROS通路的下游。
　　4.高濃度胰

25、島素培養(yǎng)一定時(shí)間后，MCs中TRPC6 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。當(dāng)Nox4或pERK1/2表達(dá)被抑制時(shí)，高胰島素下調(diào)的TRPC6蛋白表達(dá)水平顯著升高；此外當(dāng)采用NADPH氧化酶抑制劑、ROS抑制劑、ERK通路抑制劑時(shí)均能顯著增強(qiáng)高胰島素環(huán)境下MCs中TRPC6蛋白的表達(dá)，提示高胰島素可能是通過(guò)激活NADPH氧化酶/ROS/ERK信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮對(duì)MCs中TRPC6蛋白表達(dá)的抑制作用。
　　5. AS-Ⅳ可以抑制高胰島素誘導(dǎo)的

26、 MCs異常增殖、Nox4亞基的表達(dá)上調(diào)、ROS生成、ERK1/2蛋白磷酸化以及TRPC6蛋白表達(dá)下調(diào)，從而發(fā)揮對(duì)系膜細(xì)胞中高胰島素環(huán)境下的NADPH氧化酶/ROS/ERK信號(hào)通路的抑制作用。
　　結(jié)論：
　　1.高濃度胰島素可以誘導(dǎo)MCs的異常增殖，并顯著抑制系膜細(xì)胞TRPC6蛋白的表達(dá)。高胰島素誘導(dǎo)系膜細(xì)胞損傷的作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié) NADPH氧化酶/ROS/ERK信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，在該信號(hào)通路中，NADPH氧化酶性ROS