p120ctn-1和3亞型分別通過β-catenin及Kaiso途徑調(diào)控肺癌細(xì)胞增殖和周期.pdf

1、目的：
　　 我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，在E-cadherin的情況下p120ctn能夠影響肺癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力，而且我們還發(fā)現(xiàn)p120ctn-1能夠上調(diào)β-catenin，而p120ctn-3卻不能，因此我們推測(cè)p120ctn-1A與3A影響肺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制很可能是不同的。D120ctn-1很可能是通過β-catenin激活經(jīng)典的WNT通路影響細(xì)胞的增殖，而D120ctn-3則很可能通過其他的因素而影響肺癌細(xì)胞的增殖。盡管已有

2、文獻(xiàn)報(bào)道p120ctn-3具有抑制細(xì)胞周期的作用，但p120ctn-3影響細(xì)胞周期的真正的分子機(jī)制還不十分清楚。Kaiso是作為p120ctn結(jié)合的配體而被發(fā)現(xiàn)的一種核BTB/POZ-ZF轉(zhuǎn)錄抑制因子，Kaiso能夠識(shí)別DNA啟動(dòng)子上的特異性序列TCCTGCnA（即Kaiso-binding sites，KBS），抑制相應(yīng)基因的表達(dá)。由于細(xì)胞周期蛋白cyclinD1啟動(dòng)子中也含有KBS序列，因此很可能是其潛在的下游靶基因。有趣的是，Ka

3、iso與p120ctn的結(jié)合部位-鋅指結(jié)構(gòu)恰恰也是它與KBS序列的結(jié)合部位。因此，我們?cè)O(shè)想：p120ctn-3很可能通過與Kaiso的結(jié)合，影響了Kaiso與KBS的結(jié)合，并影響KaisoN的核/漿分布，從而影響cyclinD1的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響細(xì)胞周期。因此，我們通過過表達(dá)和干擾p120ctn，以及過表達(dá)和敲除Kaiso，分別探討p120ctn-1A和3A通過Kaiso對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和周期的影響。
　　 方法：
　　 1

4、、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 肺腺癌SPC細(xì)胞系、A549細(xì)胞系購自ATCC。SPC和A549細(xì)胞分別在含有10％胎牛血清（GBICO Inc.，NY，USA）的RPMI 1640培養(yǎng)基（GBICO Inc.，NY，USA）和含有10％胎牛血清（GBICO Inc.，NY，USA）的DMEM培養(yǎng)基（GBICO Inc.，NY，USA）中培養(yǎng)（37℃，5％CO2）。
　　 2、四甲基偶氮唑鹽（tetrazolium，MTT）法檢測(cè)細(xì)胞

5、增殖能力
　　 取對(duì)數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，分別接種于4個(gè)96孔板培養(yǎng)板。接種24小時(shí)后加入各種處理因素。處理后第24、48、72、96小時(shí)分別加入MTT（5mg/ml）20μl，繼續(xù)孵育4小時(shí)后，每孔加入150μlDMSO溶解結(jié)晶，選擇波長550nm在酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度。
　　 3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期
　　 收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞制成1×107個(gè)/ml細(xì)胞懸液。取1ml細(xì)胞

6、懸液75％冷乙醇于4℃固定過夜、離心后制成500 μl的細(xì)胞懸液，加碘化丙啶染液于4℃避光孵育45分鐘后上機(jī)檢測(cè)，ModFitLT3.0軟件分析細(xì)胞周期。
　　 4、RT-PCR
　　 轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，用Trizol Reagent（Invitrogen，CA，USA）提取后細(xì)胞的總RNA，具體操作步驟按說明書進(jìn)行。用TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0（TaKaRa Biotechnolo

7、gy Co.，Japan）逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，分別擴(kuò)增Kaiso、β-catenin、cyclinD1、cyclinE，以β-actin為內(nèi)參。用 NIH image 軟件分析產(chǎn)物條帶灰度，以目的產(chǎn)物條帶灰度值與 β-actin產(chǎn)物條帶灰度值的比值作為mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　 5、Western blot
　　 收集細(xì)胞，提取總蛋白，蛋白定量。收集足量目的細(xì)胞，用皮爾斯公司核漿分離試劑盒

8、，具體步驟按說明書嚴(yán)格進(jìn)行，分別提取核/漿蛋白，蛋白定量。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，然后用3％小牛血清封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育2小時(shí)后ECL發(fā)光，曝光膠片后，蛋白條帶經(jīng)BioImaging Systems（UVP，CA，USA）采集后進(jìn)行灰度值測(cè)定，目的蛋白灰度值與內(nèi)對(duì)照β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后即為其相對(duì)蛋白定量。
　　 6、ChIP
　　 在GENEBANK中查找出cyclinD1啟動(dòng)子基因序列（

9、GenBank：AY439218.1），設(shè)計(jì)相應(yīng)含有KBS序列的啟動(dòng)子片段引物（委托TAKARA公司完成），上游：5'-CCCT CTCATGTAACCACGAA-3’，下游：5’-TGGTTTTGTTGGGGGTGTAG-3’，退火55癌℃，擴(kuò)增片段為179bp。用Upstate公司ChIP試劑盒，具體步驟按說明書進(jìn)行。RT-PCT檢測(cè)最終目的片段。
　　 7、免疫熒光染色
　　 接種細(xì)胞于24孔板中，PBS沖洗三次。

10、4％的多聚甲醛于冰上固定，PBS沖洗三次。洗過后用0.2％的triton-X100于常溫打孔15-30分鐘，PBS沖洗三次。打孔后用1％的BSA常溫封閉30分鐘。封閉完后棄去封閉液加入一抗，p120ctn（1:200）和Kaiso羊多抗（1:100），4℃孵育過夜。PBS沖洗三次，在暗室中加入羊抗鼠二抗FITC（1:100），室溫孵育1個(gè)小時(shí)，用PBS沖洗后，加入兔抗羊二抗TRITC（1:100），室溫孵育1個(gè)小時(shí)，PBS沖洗后，加入H

11、oechst1:200稀釋于PBS中，室溫孵育3分鐘，PBS沖洗后，用熒光顯微鏡觀察。
　　 8、免疫共沉淀
　　 提取的蛋白中加入4μg的誘餌蛋白抗體，充分混勻后4℃孵育2小時(shí)后加入25μl Protein G Microbeads，混勻后繼續(xù)4℃孵育1小時(shí)。按照操作說明步驟，混合液過μ柱，SDS上樣緩沖液沖洗μ柱，收集免疫共沉淀產(chǎn)物，Western blot進(jìn)行檢測(cè)。
　　 9、統(tǒng)計(jì)分析
　　 使用S

12、PSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。所有以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示的數(shù)據(jù)，其實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，使用Mann-Whitney U test和Kruskal-Wallis test統(tǒng)計(jì)Western blot、RT-PCR、MTT assay、細(xì)胞周期及ChIP的結(jié)果。P值<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 在A549和SPC細(xì)胞中，干擾總p120ctn細(xì)胞增殖能力顯著降低，分別回復(fù)p120ctn-1和3亞型

13、后均有效的回復(fù)了細(xì)胞的增殖能力；在A549和SPC細(xì)胞中，干擾總p120ctn，細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例增高，S期細(xì)胞比例顯著降低，分別回復(fù)p120ctn-1A或p120ctn-3A后，SPC-K2的G0/G1期細(xì)胞比例均明顯下降，S期顯著升高：在A549和SPC細(xì)胞中，p120ctn-1和3亞型均能有效上調(diào)cyclinD1和cyclinE的蛋白和mRNA水平；在SPC-K2細(xì)胞中分別瞬轉(zhuǎn)回復(fù)p120ctn-1和3亞型后，kaiso的蛋

14、白和mRNA水平?jīng)]有變化，回復(fù)p120ctn-1后B-catenin的蛋白和mRNA水平顯著上調(diào)，而回復(fù)p120ctn-3后β-catenin蛋白和mRNA水平無明顯改變；ChIP證實(shí)kaiso可以與cyclinD1啟動(dòng)子區(qū)的KBS序列結(jié)合；在A549和SPC細(xì)胞中，kaiso能夠有效的調(diào)控cyclinD1和cyclinE的蛋白和mRNA水平；免疫共沉淀方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在A549和SPC兩種細(xì)胞系中p120ctn-3可以與kaiso結(jié)合，

15、而未能檢測(cè)出p120ctn-1與kaiso的結(jié)合；ChIP檢測(cè)在A549中過表達(dá)p120ctn-1后kaiso與cyclinD1啟動(dòng)子結(jié)合情況無明顯改變，而過表達(dá)p120ctn-3后kaiso與cyclinD1啟動(dòng)子結(jié)合明顯減少，幾乎檢測(cè)不到；免疫熒光和核/漿分離蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，p120ctn-3能夠有效調(diào)控kaiso的亞細(xì)胞定位，kaiso的出核依賴于p120ctn-3的出核轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 結(jié)論：
　　 1、p120ctn