大鯢虹彩病毒細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗免疫應(yīng)答機(jī)理與保護(hù)效果研究.pdf

1、大鯢（Chinese giant salamander, Andrias davidianus），俗名“娃娃魚”，是我國珍稀的名貴特產(chǎn)，具有很高的食用、科研及藥用價(jià)值，屬于國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，已被列入CITES公約附錄Ⅰ中。大鯢虹彩病毒病是近年來我國大鯢養(yǎng)殖業(yè)中新暴發(fā)的一種高度傳染性疾病，其病原為大鯢虹彩病毒（Giant salamander iridovirus，GSIV），給大鯢養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了大鯢養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)

2、展。免疫預(yù)防被認(rèn)為是預(yù)防水生動(dòng)物傳染性疾病最為有效的方法。本論文對(duì)大鯢虹彩病毒細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗的最適免疫劑量、大鯢免疫后的外周血免疫指標(biāo)變化規(guī)律與保護(hù)效果以及免疫佐劑的增效作用等進(jìn)行了研究，旨在建立一種大鯢虹彩病毒病的免疫預(yù)防技術(shù)。本論文的主要內(nèi)容如下：
　　1.將健康大鯢80尾隨機(jī)分成四組，分別以不同劑量（lgTCID50ml-1）的細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗免疫大鯢。在免疫后7、14、21、28d，隨機(jī)從各免疫組與對(duì)照組中選取兩尾大鯢，

3、尾靜脈采血進(jìn)行中和抗體滴度測(cè)定。免疫30d后，進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，每尾大鯢經(jīng)腹腔注射100 ul的1.0ⅹ106 TCID50 ml-1的GSIV，連續(xù)觀察14d，記錄死亡情況，評(píng)價(jià)不同劑量的疫苗免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示，免疫劑量為1.0ⅹ106 TCID50 ml-1的試驗(yàn)組，在人工感染試驗(yàn)后，其相對(duì)免疫保護(hù)力可達(dá)72％。該結(jié)果為確定疫苗的最適免疫劑量提供了依據(jù)。
　　2.以β-丙內(nèi)酯滅活的大鯢虹彩病毒（GSIV）通過腹腔注射途徑免疫健

4、康大鯢，分別于免疫后的1、2、4、7、14、21、28d采集試驗(yàn)大鯢外周血及組織樣，進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，測(cè)定細(xì)胞的吞噬活性、血清的抗體效價(jià)及免疫相關(guān)基因的變化，并在免疫后第30天進(jìn)行攻毒感染試驗(yàn)。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)量分別在第4天和第7天呈極顯著差異（P＜0.01）。此外，也引起中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞不同種類白細(xì)胞分類百分比的變化。中性粒細(xì)胞（neutrophil）分類百分比從第2天開始升高，第4天達(dá)到峰值

5、，極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；單核細(xì)胞（monocyte）和中性粒細(xì)胞的變化趨勢(shì)比較相似，第7天達(dá)到峰值，隨后淋巴細(xì)胞大量增殖，第21天淋巴細(xì)胞分類百分比達(dá)峰值(70.45±7.52%)。免疫應(yīng)答早期，吞噬細(xì)胞的吞噬活性也迅速提高，吞噬百分比（PP）和吞噬指數(shù)（PI）第四天達(dá)峰值，分別為38.78±4.33%和3.75±0.52。血清微量中和試驗(yàn)結(jié)果表明，免疫后第21天抗體效價(jià)最高（341±9.52）。免疫相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示

6、，免疫4d后，免疫組TLR9在腎、脾臟中表達(dá)極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），而MyD88在脾、腎臟中的表達(dá)量在免疫7d后極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。免疫大鯢的攻毒感染試驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)保護(hù)率為72%。
　　3.以添加鋁膠佐劑和弗氏完全佐劑的GSIV滅活疫苗，為兩個(gè)試驗(yàn)組，設(shè)置無佐劑疫苗對(duì)照組和空白對(duì)照組（PBS）。分別在免疫后1～6周，每周隨機(jī)從各免疫組與對(duì)照組中選取兩尾大鯢，進(jìn)行尾靜脈采血，利用微量中和試驗(yàn)檢測(cè)各個(gè)試驗(yàn)組

7、的抗體水平變化。免疫60天后，進(jìn)行攻毒感染試驗(yàn)，觀察記錄死亡狀況，計(jì)算其相對(duì)免疫保護(hù)率，比較不同佐劑對(duì)GSIV滅活疫苗免疫效果的影響。結(jié)果表明，GSIV細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗添加弗氏完全佐劑后，免疫大鯢產(chǎn)生的抗體效價(jià)最高（640±15.52），顯著高于鋁膠佐劑試驗(yàn)組與無佐劑疫苗對(duì)照組，且抗體滴度持續(xù)時(shí)間相對(duì)較長，其相對(duì)免疫保護(hù)率達(dá)到90%，顯著高于鋁膠佐劑試驗(yàn)組（84%）。該結(jié)果為使用GSIV滅活疫苗免疫大鯢時(shí)選擇合適佐劑提供了一定的理論依據(jù)