馬鼻肺炎滅活疫苗的研制及其免疫效果的研究.pdf

1、馬鼻肺炎是馬屬動(dòng)物的主要傳染病之一，主要傳播途徑為接觸性傳播，即健康馬匹通過接觸排毒期馬匹的排泄物，或與排毒期馬匹共同進(jìn)食，都會(huì)感染該病。該病病原分別是馬皰疹病毒1型(Equine herpesvirus1，EHV-1)和馬皰疹病毒4型(EHV-4)。感染EHV-4的患畜臨床病征表現(xiàn)為呼吸道疾病、發(fā)熱、食欲不振等；而感染EHV-1的患畜則更為嚴(yán)重，除表現(xiàn)出4型臨床表征外，還會(huì)引起孕馬流產(chǎn)、新生馬駒死亡、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等癥狀。雖然感染馬鼻肺

2、炎后死亡率不高，但是其引起的后遺癥會(huì)給種馬、賽馬等帶來巨大的健康隱患。目前防制該病所采取的主要措施為疫苗免疫，通常為傳統(tǒng)的滅活苗和減毒苗，國內(nèi)目前還沒有商品化的馬鼻肺炎疫苗，因此，制備一株能夠有效防制我國該病的疫苗則具有理論和實(shí)際意義的。
　　 本實(shí)驗(yàn)選取了2010年從黑龍江省分離到的馬皰疹病毒，經(jīng)測序分析，其gG基因與EHV-8亞型同源性高達(dá)99％以上，而其他幾個(gè)影響病毒毒力的主要蛋白基因序列與標(biāo)準(zhǔn)EHV-1有90%以上的同源

3、性。該毒株通過馬體人工感染試驗(yàn)可引發(fā)馬鼻肺炎臨床表征。用該毒株經(jīng)馬胎皮細(xì)胞進(jìn)行傳代，穩(wěn)定傳10代后，病毒毒力保持在106TCID50/mL左右。用滅活劑β-丙內(nèi)酯(BLP)滅活方法可直接作用于病毒核酸，不會(huì)破壞病毒蛋白結(jié)構(gòu)，使破滅活的病毒保持較好的免疫原性；易水解，滅活后在37℃條件下水浴2h即可完全降解，水解產(chǎn)物為β-羥基丙酸。滅活后的病毒通過蔗糖密度梯度離心和超濾兩種方式進(jìn)行純化，通過比較純化后疫苗誘發(fā)的免疫效果可以看出，兩者純化效

4、果相似，但是超濾方法更為簡便。本研究分別建立了以純化的疫苗株為抗原的間接ELISA及定量檢測EHV-1、EHV-8DNA的SYBR Green I熒光定量PCR進(jìn)行檢測免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體水平以及人工感染后的排毒情況。試驗(yàn)動(dòng)物選擇6周齡Balb/c雌鼠，分別于0d、17 d和38 d進(jìn)行免疫，在三次免疫后取小鼠血清進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)，中和抗體效價(jià)可達(dá)1:100，并用馬鼻肺炎病毒株攻擊以及通過定量PCR檢測小鼠肺組織內(nèi)病毒DNA變化，免疫組小