金屬蛋白酶ADAMTS-7在軟腳骨發(fā)育以及骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、關(guān)節(jié)炎是一組以關(guān)節(jié)軟骨破壞及關(guān)節(jié)周圍軟組織炎癥為特征的慢性疾病。其中最常見的關(guān)節(jié)炎類型為骨關(guān)節(jié)炎，以關(guān)節(jié)軟骨的破壞與降解為主。另一常見類型為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，是一類慢性全身性自身免疫疾病，以滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)。關(guān)節(jié)炎的發(fā)病趨勢(shì)隨著人口高速增長(zhǎng)以及全球人口老齡化的加劇而日趨嚴(yán)重，但是目前為止，關(guān)節(jié)炎發(fā)病的具體病因，發(fā)病機(jī)制仍不明確。ADAMTS(ADisintegrinandMetalloproteinasewithThro

2、mbospondinmotifs)含TSP樣基序的去整合素金屬蛋白酶家族，為一組結(jié)構(gòu)相似的分泌性鋅結(jié)合蛋白酶，目前已發(fā)現(xiàn)19個(gè)成員，它們的蛋白結(jié)構(gòu)具有高度的相似性，在體內(nèi)以多種細(xì)胞外基質(zhì)成分為底物，而且它們?cè)谂咛グl(fā)育、血管生成、凝血等生理過(guò)程中具有重要功能。研究表明ADAMTS-7的表達(dá)水平在關(guān)節(jié)炎病人軟骨中明顯上升，但是其在關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的今天作用尚不清楚。我們運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)與RNAi基因下調(diào)技術(shù)建立了小鼠模型，對(duì)ADAMTS-7的

3、功能進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
　　 一.ADAMS-7在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用研究
　　 ADAMTS-7屬于ADAMTS家族成員，以往的研究表明ADAMTS-7結(jié)合并降解軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilageoligomericmatrixprotein，COMP)，同時(shí)其表達(dá)水平在關(guān)節(jié)炎病人中明顯上調(diào)。此外，后續(xù)的體外實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)ADAMTS-7在調(diào)節(jié)軟骨發(fā)生中起到重要的作用，為了更好地闡明其在軟骨發(fā)育以及關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)

4、程中的功能，我們率先構(gòu)建了人ADAMTS-7轉(zhuǎn)基因小鼠，采用軟骨細(xì)胞特異性Ⅱ型膠原纖維(Co(l)2a(1))作為轉(zhuǎn)入基因的啟動(dòng)子，我們發(fā)現(xiàn)新生的ADAMTS-7轉(zhuǎn)基因小鼠體型明顯小于野生型對(duì)照小鼠，X光片顯示轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼發(fā)育明顯滯后，無(wú)論是長(zhǎng)骨的長(zhǎng)度和密度都明顯低于野生型小鼠。鈣黃綠素雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)顯示新生小鼠的新骨形成率明顯低于對(duì)照小鼠，番紅染色顯示轉(zhuǎn)基因小鼠的生長(zhǎng)板只有其對(duì)照小鼠的一半長(zhǎng)度，同時(shí)生長(zhǎng)板肥大區(qū)長(zhǎng)度也顯著短于對(duì)照小鼠。阿而

5、新藍(lán)及茜素紅全骨骼染色顯示ADAMTS-7轉(zhuǎn)基因小鼠的成骨發(fā)育明顯滯后與正常野生型小鼠。然而，轉(zhuǎn)基因小鼠在出生5周后達(dá)到了正常對(duì)照小鼠的體重和體型，并檢測(cè)不到任何發(fā)育異常。我們同時(shí)運(yùn)用Cre/loxp重組系統(tǒng)建立了表達(dá)ADAMTS-7特異性SiRNA的小鼠即ADAMTS-7基因下調(diào)小鼠，但在其成骨發(fā)育發(fā)育方面未見任何異常，這可能與ADAMTS家族別的蛋白成員進(jìn)行了功能代償有關(guān)。
　　 我們發(fā)現(xiàn)8月齡ADAMTS-7轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)

6、地形成了骨關(guān)節(jié)炎的表型，而其相應(yīng)對(duì)照小鼠并無(wú)明顯異常。MicroCT掃描發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠膝關(guān)節(jié)骨贅形成，番紅染色顯示其有顯著的關(guān)節(jié)軟骨蛋白聚糖丟失，并伴隨有半月板軟骨的骨化，同時(shí)我們還觀察到在其關(guān)節(jié)軟骨中軟骨細(xì)胞團(tuán)集，關(guān)節(jié)軟骨中層與下層鈣化軟骨分界潮線不規(guī)則并上移至軟骨表層，這些都是骨關(guān)節(jié)炎的特征組織學(xué)表現(xiàn)。
　　 為進(jìn)一步探討ADAMTS-7在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生及發(fā)展中所起的作用，我們建立了手術(shù)誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎模型（切斷中半月板與脛骨之

7、間的韌帶以造成膝關(guān)節(jié)的不穩(wěn)定），組織學(xué)分析顯示轉(zhuǎn)基因小鼠在術(shù)后4周就開始出現(xiàn)中度的蛋白聚糖丟失，而其相應(yīng)的對(duì)照小鼠知道術(shù)后12周后才開始表現(xiàn)出中度的蛋白聚糖丟失。組織學(xué)評(píng)分顯示相同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠術(shù)后關(guān)節(jié)炎評(píng)分明顯高于對(duì)照小鼠。除此以外，軟骨寡聚基質(zhì)蛋白COMP降解水平在術(shù)后轉(zhuǎn)基因小鼠中明顯高于對(duì)照小鼠。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子α作為一種重要的促炎因子能夠明顯促進(jìn)ADAMTS-7的表達(dá)，同時(shí)轉(zhuǎn)基因小鼠中腫瘤壞死因子α也被明顯上調(diào)

8、，我們還采用了軟骨體外培養(yǎng)加入純化的ADAMTS-7重組蛋白，也觀察到類似的腫瘤壞死因子α被上調(diào)現(xiàn)象，這表明ADAMTS-7和腫瘤壞死因子α兩者之間存在正反饋通路。
　　 二.軟骨寡聚基質(zhì)蛋白COMP作為關(guān)節(jié)炎生物標(biāo)記分子的研究
　　 關(guān)節(jié)炎作為一類高發(fā)疾病，其早期診斷以及早期干預(yù)治療尤其是在關(guān)節(jié)軟骨尚未出現(xiàn)明顯丟失之前顯得極為重要。軟骨寡聚基質(zhì)蛋白是軟骨中的一種非膠原組成成分。其降解片段水平在疾病的軟骨，關(guān)節(jié)腔滑液以及

9、關(guān)節(jié)損傷、關(guān)節(jié)外傷后、骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)的病人血清中明顯上升。雖然市場(chǎng)上已有若干商業(yè)化的COMP酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒可以用于檢測(cè)人血清中的COMP水平，但是其限制是它們?nèi)狈?duì)COMP降解片段的特異性，這也就阻礙了COMP作為臨床上監(jiān)測(cè)關(guān)節(jié)炎的生物學(xué)標(biāo)記的應(yīng)用。我們制備了一批重組針對(duì)COMP蛋白片段的鼠源單克隆抗體，并對(duì)它們進(jìn)行了詳細(xì)地分析，發(fā)現(xiàn)其中2127F5B6單抗優(yōu)先識(shí)別COMP羧基端降解片段。我們以此抗體作為檢測(cè)抗體結(jié)合COMP

10、多克隆抗體建立了全新的COMP夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。與商業(yè)化的試劑盒比較顯示，商業(yè)化檢測(cè)的COMP水平不能對(duì)有明顯癥狀的骨關(guān)節(jié)炎病人和非病人進(jìn)行區(qū)分，而我們建立的新方法能夠檢測(cè)到兩者之間明顯的差別，骨關(guān)節(jié)炎病人血清中COMP片段水平明顯高于非關(guān)節(jié)炎組。此外，血清COMP水平還與骨關(guān)節(jié)炎病人的影像學(xué)分級(jí)有很好的相關(guān)性，病情越重，關(guān)節(jié)軟骨破壞越厲害，COMP水平越高。值得注意的是，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人在使用甲氨蝶呤(MTX)和腫瘤壞死因子抑制劑

11、(TNFinhibitors)治療后，部分病人的血清COMP水平比用藥前的COMP水平明顯下降，通過(guò)對(duì)治療前后病情評(píng)分DAS28的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)這部分病人正是類風(fēng)濕藥物敏感病人，因此COMP的水平檢測(cè)能夠協(xié)助醫(yī)生進(jìn)行藥物療效的監(jiān)測(cè)以便制定更佳的治療方案。
　　 不同于大部分現(xiàn)有的COMPELISA檢測(cè)試劑盒，只適用于某一特定物種，我們的方法除可用于人COMP蛋白檢測(cè)，此方法也適用于小鼠。
　　 綜上所述，靶向性的ADAMT

12、S-7在軟骨細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)抑制幼齡小鼠的軟骨發(fā)生與成骨發(fā)育，而在成年小鼠中它導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎表型的出現(xiàn)，同時(shí)它也促進(jìn)了手術(shù)誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎模型的發(fā)生并加快了疾病的發(fā)展。ADAMTS-7調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展一是通過(guò)降解軟骨寡聚基質(zhì)蛋白導(dǎo)致軟骨基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)失去平衡，二是其通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α，而腫瘤壞死因子α反過(guò)來(lái)又可激活其它降解軟骨軟骨基質(zhì)的金屬蛋白酶，例如基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-13以及ADAMTS-4、ADAMTS-5。這些發(fā)現(xiàn)不僅闡述