人參皂苷Rb1通過Notch信號通路調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶-13防治骨關(guān)節(jié)炎的實驗研究.pdf

1、第一部分細胞實驗
　　實驗一 IL-1β對軟骨肉瘤細胞SW1353Ⅱ型膠原代謝的影響及人參皂苷Rb1對Ⅱ型膠原的保護作用
　　目的：觀察IL-1β及Rb1對軟骨細胞Ⅱ型膠原代謝的影響及人參皂苷Rb1（GRb1）對軟骨細胞的保護作用。篩選最佳GRb1藥物濃度。
　　方法：研究對象為SW1353細胞。實驗分為空白對照組、IL-1β組、人參皂苷Rb1低、中、高劑量組（20、40、80μM）。（1）用IL-1β干預(yù)SW1353

2、細胞，應(yīng)用Western Blot（WB）方法檢測空白對照組及IL-1β組CII、MMP-13的表達。（2）設(shè)定3個GRb1藥物濃度（20、40、80μM），應(yīng)用Western Blot、ELISA、消化法等方法，檢測不同濃度GRb1對IL-1β誘導(dǎo)后的SW1353細胞CII、MMP-13、 PIINP、Hyp、CTX-II表達的影響，以篩選最佳藥物濃度。
　　結(jié)果：與空白對照組比較，IL-1β組CII表達水平明顯降低，MMP-1

3、3表達水平明顯升高。GRb1能顯著下調(diào)IL-1β刺激后的MMP-13、CTX-II的高表達，上調(diào)IL-1β刺激后CII、PIINP及Hyp低表達，且成劑量依賴性。
　　結(jié)論：GRb1對IL-1β誘導(dǎo)后的SW1353細胞Ⅱ型膠原代謝有保護作用。濃度為80μM的GRb1可作為細胞干預(yù)的最佳濃度。
　　實驗二人參皂苷Rb1對IL-1β誘導(dǎo)后的Notch通路的影響
　　目的：觀察人參皂苷Rb1對IL-1β誘導(dǎo)后的Notch信號

4、通路關(guān)鍵因子表達的影響。
　　方法：以最佳GRb1濃度干預(yù)IL-1β處理后的SW1353細胞，應(yīng)用WB方法檢測Notch信號通路關(guān)鍵因子Notch1及JAG1的表達；應(yīng)用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(q-PCR)方法檢測Notch信號通路關(guān)鍵因子Notch1及JAG1 mRNA的表達。
　　結(jié)果：與IL-1β組相比，GRb1能顯著下調(diào)IL-1β誘導(dǎo)的Notch1及JAG1的高表達。
　　結(jié)論：GRb1能下調(diào)Notch

5、1及JAG1的水平，調(diào)控Notch信號通路。
　　實驗三人參皂苷Rb1調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶-13防治骨關(guān)節(jié)炎的機制研究
　　目的：通過觀察人參皂苷Rb1以及Notch信號通路特異性抑制劑DAPT對IL-1β誘導(dǎo)后的MMP-13、Notch1、JAG1蛋白和mRNA表達的影響，探討人參皂苷Rb1通過Notch信號通路調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶-13防治骨關(guān)節(jié)炎的機制。
　　方法：以最佳 GRb1濃度及 Notch信號通路特異性抑制

6、劑 DAPT干預(yù)IL-1β處理后的SW1353細胞，采用q-PCR法檢測MMP-13、Notch1及JAG1 mRNA表達，采用WB方法檢測CII、MMP-13、Notch1及JAG1的表達。
　　結(jié)果：與IL-1β組相比，GRb1組CII表達水平明顯上調(diào)；MMP-13、Notch1及JAG1表達水平明顯下降。與DAPT組相比，GRb1組CII、Notch1及JAG1表達水平較高，MMP-13表達水平較低。
　　結(jié)論：GRb

7、1能抑制 IL-1β誘導(dǎo)的 SW1353細胞 CII的低表達及MMP-13、Notch1、JAG1的高表達。GRb1對OA病程中活化的Notch信號通路有一定程度的抑制作用。GRb1對骨關(guān)節(jié)炎的保護作用可能與GRb1通過調(diào)控Notch信號通路抑制MMP-13的表達相關(guān)。
　　第二部分動物實驗
　　實驗四人參皂苷Rb1對膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠的軟骨保護作用及機制研究
　　目的：研究人參皂苷 Rb1對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型的軟骨組

8、織中CII、MMP-13、Notch1及JAG1表達的影響，探討人參皂苷Rb1對關(guān)節(jié)軟骨的保護作用及其機制。
　　方法：成年SD雄性大鼠40只，隨機選取10只作為正常對照組，其余采用國際公認的 Hulth法建立大鼠右膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）動物模型，并隨機分為模型對照組、GRb1組、DAPT組，每組各10只。造模后4周，模型對照組予以生理鹽水（0.3 mL，0.9％）膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，其余兩組分別予以GRb1（0.3 mL，80μM），

9、DAPT（0.3 mL，10μM）右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，1次/周，共6周。免疫組織化學法及Western blot方法檢測各組軟骨組織中CII、MMP-13、Notch1及JAG1的表達。ELISA法、消化法檢測大鼠血清中PIINP、Hyp以及CTX-II的表達。
　　結(jié)果：（1）HE染色結(jié)果顯示：正常組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，各層細胞形狀及排列整齊，潮線清晰。與正常組相比，模型組關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s評分升高，HE染色軟骨層次破壞，軟骨

10、層變薄，軟骨表層毛糙甚則潰瘍形成。與模型組相比，其余各處理組軟骨組織Mankin’s評分不同程度降低，軟骨結(jié)構(gòu)紊亂有明顯改善。（2）與正常組相比，模型組血清中 PIINP、Hyp表達降低，CTX-II表達明顯升高。與模型組相比，DAPT組及GRb1組血清中PIINP、Hyp表達明顯升高，CTX-II表達降低。與DAPT組相比，GRb1組血清中PIINP、Hyp表達升高， CTX-II表達降低。（3）免疫組化法檢測結(jié)果顯示：正常關(guān)節(jié)軟骨組

11、織中，CII陽性表達較多，MMP-13、Notch1及JAG1陽性表達較少。與正常組相比，模型組 CII陽性表達明顯減少，而 MMP-13、Notch1及JAG1陽性表達明顯增加。與模型組相比，GRb1及DAPT組CII陽性表達較多，MMP-13、Notch1及JAG1陽性表達較少。與DAPT組相比， GRb1組CII、Notch1及JAG1陽性表達較多，MMP-13陽性表達較少。（4）WB檢測結(jié)果顯示：與正常組相比，GRb1組 CII

12、表達較少， MMP-13、Notch1及JAG1表達增加；與模型組相比，GRb1組CII表達明顯增加，MMP-13、Notch1及JAG1表達顯著減少；與DAPT組相比，GRb1組CII、Notch1及JAG1表達增加，MMP-13表達減少。
　　結(jié)論：GRb1對大鼠膝 OA模型的軟骨組織 Mankin’s評分及結(jié)構(gòu)損傷有明顯的改善。GRb1能上調(diào)大鼠膝OA軟骨組織中CII的低表達，下調(diào)MMP-13、Notch1、JAG1的高表達