hASH1在肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、hASH1（human achaete-scute homolog 1）基因是一個(gè)bHLH（basic helix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子，首先從甲狀腺髓樣癌的cDNA文庫中克隆出來，位于12q22-q23。在脊椎動(dòng)物的發(fā)育過程中，ASH1基因通常只暫時(shí)性的表達(dá)于胚胎肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的早期分化階段，在終末分化標(biāo)記物出現(xiàn)后其表達(dá)趨于沉默。已有研究表明在具有神經(jīng)內(nèi)分泌分化的前列腺癌、甲狀腺髓樣癌、胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌中有hASH1基因

2、的表達(dá)。目前臨床常用的非激素類神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤標(biāo)志物有嗜鉻粒蛋白A（chromogranin A，CgA）、突觸素（synaptophysin，Syn）和CD56等。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)方法、Western blot和RT-PCR方法檢測正常肺組織和各型肺腫瘤中hASH1基因的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物的相關(guān)性，探討其成為更為特異和敏感的臨床病理診斷肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的標(biāo)志物的可能性。
　　 材料和方法：
　　

3、 一、材料
　　 收集166例肺癌組織蠟塊（鱗癌30例，腺癌30例，大細(xì)胞癌20例，典型類癌16例，非典型類癌20例，大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌10例，小細(xì)胞癌40例），其中35例取自遼寧省腫瘤醫(yī)院，其余取自中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院，49例肺炎性假瘤及10例癌旁正常肺組織蠟塊取自中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院。
　　 23例肺癌新鮮組織標(biāo)本（有相應(yīng)的蠟塊標(biāo)本），9例鱗癌，9例腺癌和5例小細(xì)胞癌新鮮組織均取自中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院2008年5月-

4、2009年5月手術(shù)切除標(biāo)本。
　　 二、主要試劑和來源
　　 濃縮型兔抗人ASH1多克隆抗體（ab38557）購自Abcam公司，即用型鼠抗人chromogranin A單克隆抗體（MAB-0202）、鼠抗人synaptophysin單克隆抗體（MAB-0078）、鼠抗人CD56單克隆抗體（RAB-0256）均購自福州邁新生物技術(shù)公司。
　　 三、方法
　　 （一）免疫組織化學(xué)染色
　　 蠟塊標(biāo)本

5、切片后按照鏈菌素抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組化法（SP法）檢測，所有標(biāo)本均檢測hASH1（1:100）蛋白，所有肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌標(biāo)本均檢測CgA、Syn和CD56的表達(dá)情況，以磷酸緩沖液PBS代替一抗作為陰性對照。
　　 （二）Wastern blot
　　 從組織內(nèi)提取細(xì)胞全蛋白，SDS-PAGE電泳，hASH1蛋白40V恒壓4℃濕轉(zhuǎn)100min，TBS/0.3％Tween-20/5％小牛血清室溫封閉2hrs，一抗（1

6、:500）4℃孵育過夜，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（1:5000）37℃孵育2h。內(nèi)參β-actin在電泳后以切膠方式與hASH1蛋白所在部位分開轉(zhuǎn)印。ECL顯色，X線膠片曝光成像。
　　 （三）RT-PCR
　　 利用Trizol提取組織中總的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，hASH1的引物上游序列5’-TCCCCCAACTACTCCAACGAC-3’，下游序列是5’-CCCTCCCAACGCCACTG-3’，以β-actin

7、為內(nèi)參照，循環(huán)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)后于72℃延伸5min，最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后保存圖像。
　　 （四）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對hASH1在各種肺組織中表達(dá)的差異采用χ2檢驗(yàn)（n>40）或Fisher確切概率法（n<40）分析，采用Spearman等級相關(guān)分析hASH1與CgA、Syn、CD56表達(dá)的相關(guān)性，

8、P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、免疫組織化學(xué)結(jié)果
　　 hASH1蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞核，在正常肺組織、肺炎性假瘤、肺鱗癌、肺腺癌和肺大細(xì)胞癌中不表達(dá)；在典型類癌中的表達(dá)陽性率為12.5％（2/16），在非典型類癌中的表達(dá)陽性率為75％（15/20），差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；在大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌中的表達(dá)陽性率為60％（6/10），在小細(xì)胞癌中的表達(dá)陽性率為77.5％（31/40）

9、，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；CgA、Syn在細(xì)胞漿呈現(xiàn)棕黃色細(xì)小顆粒者為陽性染色，CD56在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿呈現(xiàn)棕黃色細(xì)小顆粒者為陽性染色，36例類癌中，27例（75.0％）CgA陽性，26例（72.2％）Syn陽性，29例（80.6％）CD56陽性，在50例大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和小細(xì)胞癌中，24例（48.0％）CgA陽性，38例（76.0％）Syn陽，42例（84.0％）CD56陽性；hASH1的表達(dá)與CgA、Syn、CD56的表

10、達(dá)存在相關(guān)性（P<0.05）。
　　 二、Western blot結(jié)果
　　 hASH1蛋白在肺鱗癌和腺癌組織中不表達(dá)，在小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)。
　　 三、RT-PCR結(jié)果
　　 hASH1 mRNA在肺鱗癌和腺癌組織中不表達(dá)，在小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 hASH1基因的表達(dá)僅限于肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中，對肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤具有高度的特異性和較高的敏感性，可能成為肺神經(jīng)分泌