卷柏提取物降脂保肝作用及對HUVEC細胞VEGF蛋白表達影響的實驗研究.pdf

1、　　卷柏為蕨類卷柏科(Selaginellaceae)卷柏屬(Selaginella)植物卷柏(Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring)的全草。為了解卷柏物質基礎,本實驗室前期,對卷柏化學成分進行了全面系統(tǒng)的研究,從中分離得到大量的黃酮類、木脂素類、核苷類和其他多酚類化合物成分；活性研究采用去卵巢大鼠模型研究卷柏雌激素作用時發(fā)現(xiàn)卷柏提取物具有降脂活性,且正丁醇部位降脂活性最佳?？紤]工藝要適合工業(yè)化大生

2、產(chǎn),采用新的卷柏提取方法為：卷柏70%乙醇回流提取得到總部位,將總部位上聚酰胺柱,依次以水、50%乙醇、80%乙醇梯度洗脫,洗脫液減壓濃縮、干燥得各洗脫部位,并通過糖尿病大鼠模型和高脂血癥大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)卷柏降脂降糖活性主要集中于卷柏 80%乙醇部位(即黃酮類化合物),該部位具有抗氧化和清除自由基,降膽固醇、降血脂、降糖、改善胰島素抵抗等多種功效。
　　工藝通過中試驗證發(fā)現(xiàn)其成本較高,因此在前期實驗的基礎上對卷柏的提取方法改為：

3、95%乙醇回流藥渣水提法,卷柏全草 95%乙醇回流提取,提取物減壓濃縮干燥得到 95%乙醇部位。95%乙醇提取后的藥渣用水煎煮,水煎液減壓濃縮干燥得到藥渣水提物。
　　本課題在前期研究的基礎上,以卷柏80%乙醇部位為對照,并采用新的提取方法對卷柏提取物干預和治療非酒精性肝損傷進行研究,以期篩選出卷柏黃酮降脂保肝作用的最優(yōu)劑量及卷柏黃酮富集的最佳提取方法,同時為明確卷柏黃酮在預防和治療非酒精性肝損傷和動脈粥樣硬化的作用機理奠定基礎

4、。
　　第一部分 卷柏提取物對飲食誘導肝損傷大鼠預防和治療作用的實驗研究
　　目的：建立 Wistar大鼠飲食誘導肝臟脂肪變性模型,初探卷柏提取物降脂保肝作用機制。
　　方法：成年Wistar大鼠70只,雌雄各半,體重為(200±20) g,適應性喂養(yǎng)一周,隨機分出10只為正常對照組；其余動物腹腔注射60萬單位維生素D3的同時給予高脂飼料,實驗動物自由飲水、進食。造模開始后干預組在造模的同時給藥,治療組造模成功后

5、給藥。
　　給藥12周后處死老鼠,測定體重、肝重,計算肝指數(shù)；取血清測定生化、肝功、血流變、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)指標；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定脂肪酸β氧化相關蛋白—肉毒堿棕櫚酰轉移酶Ⅰ(CTP-Ⅰ)和脂酰輔酶A合成酶(ACS)的活性；光鏡和電鏡下觀察肝臟組織結構變化。
　　結果：給藥12周后,干預實驗中模型組大鼠血清生化指標及肝功指標等顯著升高,血清MDA含量增加,SOD含量降低(與正常組比

6、P﹤0.01),全血粘度、血漿粘度、紅細胞剛性指數(shù)顯著升高,紅細胞變形指數(shù)顯著減低,但紅細胞壓積沒有變化；肝臟CTP-1和ACS水平顯著減低(與正常組比P﹤0.01),給藥組各項指標明顯改善,其中以卷柏95%部位和卷柏80%Ⅱ部位作用最好。病理切片HE染色光鏡照片發(fā)現(xiàn),正常組肝組織切片肝組織功能基本正常；模型組肝細胞形成了以大泡性為主的肝細胞脂肪變,給藥后各組肝臟病理改變一定的改善作用。
　　治療組造模一月后模型組大鼠出現(xiàn)了廣泛

7、的細胞內小泡性脂肪變性,說明造模成功。給藥12周后,治療實驗中模型組大鼠血清生化指標及肝功指標等顯著升高,血清MDA含量增加,SOD含量降低(與正常組比P﹤0.01),全血粘度、血漿粘度、紅細胞剛性指數(shù)顯著升高,紅細胞變形指數(shù)顯著減低,但紅細胞壓積沒有變化；肝臟CTP-1和ACS水平顯著減低(與正常組比P﹤0.01),給藥組各項指標明顯改善,其中以卷柏95%部位和卷柏80%Ⅱ部位作用最好。病理切片HE染色光鏡照片發(fā)現(xiàn),正常組肝組織切片肝

8、組織功能基本正常；模型組肝細胞形成了以大泡性為主的肝細胞脂肪變,卷柏提取物對各組大鼠肝臟病理改變有明顯的改善作用。觀察電鏡表現(xiàn)的嚴重程度和病理一致,即隨著肝組織病理變化的加重電鏡下的改變也呈加重趨勢。
　　結論：卷柏黃酮對高脂飼料引起的脂代謝紊亂及肝細胞脂肪變性具有較好的干預和治療作用,且具較好的量效關系。
　　第二部分 卷柏提取物及穗花杉雙黃酮對 HUVEC細胞增殖的影響
　　目的：觀察卷柏總黃酮、穗花杉雙黃酮

9、對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增殖及血管內皮細胞生長因子(VEGF)表達的影響,為動脈粥樣硬化引起的心肌和肢體缺血的促血管新生治療提供理論依據(jù)。
　　方法：采用MTT法檢測不同濃度卷柏總黃酮及穗花杉雙黃酮對 HUVEC細胞增殖的影響；流式細胞儀檢測細胞周期；Western blot檢測VEGF蛋白的表達。
　　結果：不同濃度的卷柏總黃酮(1、5、10、15、20μg·mL-1)和穗花杉雙黃酮(0.3、1、2、4、5μg