30種中草藥提取物對(duì)多子水霉體外抑制作用研究及厚樸抗水霉活性成分初步分析.pdf

1、水霉（Saprolegnia）是水霉病(Saprolegniasis)的主要病原菌之一。幾乎所有淡水水產(chǎn)動(dòng)物均易感染，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)影響巨大。孔雀石綠一度被認(rèn)為是防治水霉病的特效藥，后來發(fā)現(xiàn)其隨食物鏈進(jìn)入人體會(huì)造成肝細(xì)胞癌變。隨著孔雀石綠的禁用，水霉病重新成為危害養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的一大難題。目前養(yǎng)殖生產(chǎn)中常用抗生素、食鹽、甲醛等藥物預(yù)防和治療水霉病，但均存在防治效果不佳，或不適宜大水面養(yǎng)殖用藥等問題。
　　中草藥因其來源廣、成本低廉、

2、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)為廣大科研人員所青睞。目前在水產(chǎn)臨床用藥上使用中草藥治療水霉病還較少。開展抗水霉中草藥的篩選及主要成分的研究不僅有利于解決水霉病有效藥物缺乏的臨床問題，而且有利于增加我國(guó)藥物種類儲(chǔ)備及降低水產(chǎn)食品安全風(fēng)險(xiǎn)。
　　本研究通過查閱文獻(xiàn)從中搜集整理出了三十種可以抑制水霉等真菌的中草藥。采用提取、濃縮等技術(shù)，通過測(cè)定其抗水霉活性，篩選出了對(duì)水霉有較好抑制效果的中草藥。利用系統(tǒng)溶劑法測(cè)定厚樸不同溶劑部位抗水霉活性，并利用

3、不同檢測(cè)方法對(duì)活性最高的提取部位進(jìn)行了初步分析。
　　1.通過馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)，并經(jīng)多次純化后，從感染霉菌的草魚體表分離到一株致病霉菌CCF1301，制作水浸片，顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定。同時(shí)挑取純化后的水霉菌絲，提取基因組DNA，利用霉菌鑒定試劑盒擴(kuò)增其26S rDNAD1/D2基因和ITS基因，送測(cè)序公司進(jìn)一步測(cè)序。將獲得的序列提交NCBI，利用其Blast工具進(jìn)行同源性比對(duì)，同時(shí)利用M

4、ega5.1軟件進(jìn)行發(fā)育樹分析。結(jié)合形態(tài)學(xué)分析結(jié)果對(duì)分離株進(jìn)行綜合鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn):本次采集到的絲狀真菌菌絲呈管狀、透明、無橫隔、分支較少、無性生殖過程形成棍棒狀孢子囊并產(chǎn)生游動(dòng)孢子、有性生殖過程產(chǎn)生球形藏卵器，依據(jù)真菌鑒定手冊(cè)對(duì)水霉屬真菌的描述并結(jié)合上述特征將該分離株初步劃歸為水霉屬;利用水霉鑒定試劑盒對(duì)分離株26S rDNA D1/D2基因和ITS基因擴(kuò)增，分別得到一條800bp左右的基因片段，送公司測(cè)序后發(fā)現(xiàn)26S rDNA D1/

5、D2基因和ITS基因大小分別為839bp和798bp，將該序列提交NCBI，獲得序列號(hào)分別為KJ577573和KF871196。利用Blast工具檢測(cè)其同源性發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)基因均與水霉屬同源性最高，均達(dá)到99％以上。同時(shí)，利用Mega5.1軟件進(jìn)行發(fā)育樹構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)26S rDNA區(qū)序列與GenBank的JN400036序列（Saprolegnia Sp.）類聚為一支，初步判斷其隸屬于水霉屬，ITS區(qū)序列進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)其與JN400035序列

6、（Saprolegnia ferax）類聚為一支，判斷其為多子水霉（Saprolegnia ferax）。
　　2.將三十種候選中草藥粉碎、過篩，用95％乙醇按料液比1∶15，75℃熱回流提取1.5h，重復(fù)提取三次，合并濾液。粗提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀120r/min，0.09Mpa，75℃揮干溶劑，濃縮成浸膏后，用少量溶劑溶解，制備試驗(yàn)用藥液。利用平板法制備不同含藥培養(yǎng)基，測(cè)定2.0g/L（原生藥計(jì)）藥液濃度對(duì)水霉的抑制效果。將具有抑制

7、效果的藥物重新挑選，利用微量稀釋法測(cè)定不同藥物對(duì)水霉孢子的最小抑菌濃度。結(jié)果表明:厚樸、狼毒、五倍子、苦參、丁香這五種藥的95％乙醇提取物對(duì)水霉具有較好的抑制作用，其最小抑菌濃度分別為2.5×10-1 g/L（原生藥計(jì)）、2.5×10-1g/L（原生藥計(jì)）、62.5×10-3g/L（原生藥計(jì)）、62.5×10-3g/L（原生藥計(jì)）、0.5g/L（原生藥計(jì)）;其它二十六種藥的95％乙醇提取物對(duì)水霉的最小抑菌濃度均≥2.0g/L（原生藥計(jì)）

8、。由此可以看出，厚樸和狼毒具有較好的抗水霉效果。由于狼毒天然毒性較強(qiáng)，考慮厚樸作為進(jìn)一步研究的對(duì)象。
　　3.利用系統(tǒng)溶劑法，選擇石油醚(60～90)、乙酸乙酯、無水乙醇、冰乙酸、水五種溶劑依次提取厚樸不同活性部位，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，揮干溶劑并用少量乙醇溶解定容。同時(shí)，用微量稀釋法測(cè)定五個(gè)提取部位抗水霉最小抑菌濃度，確定效果最好的最佳提取部位。使用不同方法進(jìn)一步對(duì)抗水霉最佳活性部位可能成分進(jìn)行初步檢識(shí)。結(jié)果顯示:與其他提取部位相