膜表達(dá)型InsB15-23和IGRP206-214H-2Kd單鏈三聚體真核表達(dá)載體對(duì)NOD小鼠Ⅰ型糖尿病的影響.pdf

1、Ⅰ型糖尿病(TID)是一種器官特異性自身免疫性疾病。在疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)多種自身抗原，包括胰島素(Ins)、谷氨酸脫羧酶(GAD)、葡萄糖-6-磷酸催化亞基相關(guān)蛋白(IGRP)等，其中有些抗原表位在疾病的進(jìn)程中扮演著重要的角色，如InsB15-23、GAD65P90、IGRP206-214，而且它們之間還存在抗原表位擴(kuò)展的現(xiàn)象。在Ⅰ型糖尿病進(jìn)程中，InsB15-23特異性CTL被認(rèn)為是起始的抗原表位特異性CTL，對(duì)于其他抗原表

2、位的暴露及相應(yīng)CTL的誘導(dǎo)起到了關(guān)鍵性作用;葡萄糖-6-磷酸催化亞基相關(guān)蛋白(IGRP)是多種膜系統(tǒng)的組成成分，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)采用毒素偶聯(lián)的四聚體選擇性清除IGRP206-214特異性CTL，能夠顯著性延遲NOD小鼠Ⅰ型糖尿病的發(fā)生。因此本研究選取InsB15-23、IGRP206-214做為研究對(duì)象，分別觀察mInsB15-23H-2KdSCT、mIGRP206-214H-2KdS CT兩種膜表達(dá)型單鏈三聚體對(duì)NOD小鼠Ⅰ型糖尿病進(jìn)程的影

3、響。
　　我們首先以本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的mInsB15-23H-2KdSCT真核表達(dá)載體為基礎(chǔ)，進(jìn)一步構(gòu)建mIGRP206-214H-2KdSCT真核表達(dá)載體，然后用mInsB15-23H-2KdSCT真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，用H-2Kd的抗體作為一抗，通過(guò)免疫熒光法確定mInsB15-23H-2KdSCT能夠在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并定位在細(xì)胞膜上。
　　采用mInsB15-23H-2KdSCT和mIGRP206-214H-2

4、KdSCT兩種真核表達(dá)載體分別給3周齡、7周齡的NOD母鼠皮下注射，以皮下注射pCDNA3.1(-)真核表達(dá)載體組小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，發(fā)現(xiàn)mInsB15-23-H-2KdSCT組與對(duì)照組相比，NOD小鼠的動(dòng)態(tài)血糖、30周齡時(shí)平均血糖和發(fā)病率均比對(duì)照組低，表明mInsB15-23-H-2KdSCT具有顯著延遲NOD小鼠血糖升高的趨勢(shì)，而mIGRP206-214-H-2Kd-SCT組與對(duì)照組相比，NOD小鼠的動(dòng)態(tài)血糖、30周齡時(shí)平均血糖和發(fā)病

5、率均比對(duì)照組高，表明mIGRP206-214H-2KdSCT沒(méi)有延遲NOD小鼠血糖升高的趨勢(shì)。
　　為了探索mInsB15-23H-2KdSCT和mIGRP206-214H-2KdSCT延遲NOD小鼠血糖升高的機(jī)制，我們?cè)噲D制備相關(guān)H-2Kd四聚體，用于檢測(cè)NOD小鼠體內(nèi)特異性CTL的變化。我們以本實(shí)驗(yàn)室前期制備的pET22b-InsB15-23-β-2m-H-2-Kd為基礎(chǔ)，通過(guò)基因工程的方法成功地構(gòu)建了pET22b-IGRP2

6、06-214-β2m-H-2-Kd原核表達(dá)載體。通過(guò)包涵體的洗滌、蛋白純化、復(fù)性、超濾、截留、交換buffer、生物素化、去游離生物素、然后將將純化蛋白與一定量PE標(biāo)記的鏈酶親和素共孵育，成功制備PE標(biāo)記的IGRP206-214四聚體（IGRP206-214-Tetramer-PE）。選用NOD小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以BALB/c小鼠作為陰性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)NOD小鼠IGRP206-214-Tetramer+、CD8+雙陽(yáng)性細(xì)胞高于對(duì)照組，且存在

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異，證明我們制備的此四聚體能夠用于IGRP206-214特異性CTL的檢測(cè)。
　　我們使用mInsB15-23H-2KdSCT真核表達(dá)載體在NOD小鼠3周齡時(shí)進(jìn)行皮下接種、mIGRP206-214H-2KdSCT真核表達(dá)載體在NOD小鼠7周齡時(shí)進(jìn)行皮下接種，利用自制的IGRP206-214-Tetramer分析其對(duì)外周血IGRP206-214特異性CTL的影響。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)mInsB15-23H-2KdSCT的NOD小

8、鼠在16、40周齡時(shí)外周血IGRP206-214特異性CTL比例有降低的趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;由于時(shí)間的限制，我們沒(méi)有在最佳的時(shí)間點(diǎn)(8周、10周、12周)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，因此過(guò)表達(dá)mInsBI5-23H-2KdSCT能否降低IGRP206-214特異性CTL頻率尚無(wú)法判斷;而接種了mIGRP206-214H-2KdSCT真核表達(dá)載體的NOD小鼠外周血IGRP206-214特異性CTL頻率與對(duì)照組相比經(jīng)歷了增高、又趨于相同的變化過(guò)

9、程，表明mIGRP206-214H-2KdSCT可能具有誘導(dǎo)IGRP206-214特異性CTL增殖的功能。
　　全文表明針對(duì)疾病早期暴露的抗原(Ins)，過(guò)表達(dá)mInsB15-23H-2Kd-SCT可以顯著降低NOD小鼠T1D的發(fā)病率;但是尚無(wú)法判斷其能否降低NOD小鼠IGRP206-214特異性CTL數(shù)量;針對(duì)疾病中后期暴露的抗原(IGRP)，盡管過(guò)表達(dá)mIGRP206-214H-2Kd-SCT能增加NOD小鼠IGRP206-2