mInsB15-23H-2Kd-SCT真核表達(dá)載體對(duì)NOD小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響.pdf

1、Ⅰ型糖尿病(Type1 Diabetes，T1D)是由于自身免疫耐受機(jī)制被打破而引發(fā)的自身免疫病。遺傳、環(huán)境、病毒感染、免疫功能異常等因素均能引發(fā)糖尿病。利用自身抗原在Ⅰ型糖尿病發(fā)病前期進(jìn)行免疫干預(yù)，以期減緩或阻止胰島中自身免疫的過(guò)程，對(duì)T1D發(fā)揮預(yù)防作用，是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
　　非肥胖型糖尿病小鼠(non-obese diabetic，NOD)能自然發(fā)生Ⅰ型糖尿病，在疾病早期（3～4周齡）發(fā)生胰島炎，進(jìn)行性破壞胰島β細(xì)胞，1

2、2周齡開(kāi)始出現(xiàn)臨床癥狀，30周齡雌鼠累計(jì)發(fā)病率可達(dá)80％，是目前研究Ⅰ型糖尿病的主要?jiǎng)游锬Ｐ?。在NOD小鼠Ⅰ型糖尿病病程中，啟動(dòng)抗原是胰島素(insulin)，特異性CD8+T細(xì)胞毒T細(xì)胞發(fā)揮著重要作用。InsulinB15-23（簡(jiǎn)寫(xiě)為InsB15-23）是H-2Kd限制性的優(yōu)勢(shì)表位，該抗原肽與親和力很低。為了研究InsB15-23表位在T1D病程中的作用，前期本實(shí)驗(yàn)室引入了二硫鍵捕獲型單鏈三聚體技術(shù)提高InsB15-23和H-2Kd

3、的親和力，構(gòu)建了膜表達(dá)型InsB15-23H-2KddtSCT(簡(jiǎn)寫(xiě)為mInsB15-23 dtSCT)真核表達(dá)載體，該載體能夠過(guò)表達(dá)mInsB15-23H-2Kd分子。用該載體和弗氏佐劑一起皮下接種3周齡NOD雌鼠，意外發(fā)現(xiàn)能降低NOD小鼠Ⅰ型糖尿病發(fā)病率，胰島局部單個(gè)核細(xì)胞的浸潤(rùn)程度大大減輕。深入研究過(guò)表達(dá)mInsB15-23 dtSCT的免疫保護(hù)作用和闡明其具體機(jī)制，為T1D等自身免疫病的干預(yù)治療提供一個(gè)新思路。
　　在以往

4、研究的基礎(chǔ)上，我們?cè)噲D研究NOD小鼠過(guò)表達(dá)mInsB15-23H-2Kd產(chǎn)生的免疫保護(hù)作用機(jī)制，是否通過(guò)直接作用導(dǎo)致CTLs凋亡，減少特異性CTL數(shù)量？或者通過(guò)Th細(xì)胞亞群的分化間接影響特異性CTL數(shù)量和功能？
　　為了排除弗氏佐劑對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，我們首先單用mInsB15-23 dtSCT真核表達(dá)載體皮下連續(xù)免疫3周齡的NOD雌鼠，連續(xù)監(jiān)測(cè)血糖，發(fā)現(xiàn)30周齡時(shí)平均血糖和發(fā)病率均下降，胰島炎分級(jí)評(píng)分發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組胰島中單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)程度

5、降低，證實(shí)單純利用mInsB15-23dtSCT真核表達(dá)載體進(jìn)行早期免疫干預(yù)能夠延緩T1D疾病進(jìn)程，降低發(fā)病率，對(duì)NOD鼠具有免疫保護(hù)作用。
　　CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞是介導(dǎo)T1D發(fā)生的主要效應(yīng)細(xì)胞，我們重點(diǎn)研究過(guò)表達(dá)mIns15-23H-2Kd-SCT是否通過(guò)直接或間接作用調(diào)控T細(xì)胞亞群發(fā)揮免疫保護(hù)作用的。利用自己制備的InsB15-23dtSCT四聚體檢測(cè)NOD小鼠體內(nèi)insulin特異性CD8+T細(xì)胞。Insulin

6、特異性CTL在NOD鼠3-4周齡時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)，隨NOD鼠周齡增加，會(huì)被其他抗原特異性CTL取代。我們?cè)谔禺愋訧nsB15-23CTL出現(xiàn)的時(shí)相內(nèi)選取6周齡，8周齡和10周齡三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分析NOD鼠體內(nèi)CTL頻率，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)mIns15-23H-2Kd能夠降低6周齡NOD小鼠體內(nèi)特異性CTL頻率，說(shuō)明過(guò)表達(dá)mInsB15-23H-2Kd能夠減少NOD小鼠特異性InsB15-23CTL數(shù)量，進(jìn)而影響抗原表位擴(kuò)展。通過(guò)分析NOD小鼠T1D疾病進(jìn)程

7、中Th細(xì)胞的變化，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)mInsB15-23H-2Kd的NOD鼠在糖尿病前驅(qū)期（12周齡和16周齡），體內(nèi)Th1細(xì)胞頻率顯著降低，而16周齡時(shí)Th2細(xì)胞頻率增加，但整個(gè)過(guò)程具有負(fù)向調(diào)控作用的Treg細(xì)胞卻沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明接種mInsB15-23 dtSCT重組質(zhì)粒能夠影響Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞之間的平衡，而與Treg細(xì)胞數(shù)量無(wú)關(guān)。過(guò)表達(dá)mInsB15-23H-2Kd減少NOD小鼠特異性InsB15-23CTL數(shù)量、促進(jìn)Th2細(xì)