金屬硫蛋白Ⅰ+Ⅱ在七氟烷預處理大鼠海馬神經(jīng)元延遲性保護中的功能.pdf

1、第一章七氟烷預處理對大鼠肝、腦及心臟基因表達譜的影響
　　目的:利用DNA芯片方法探討七氟烷預處理對大鼠肝臟、腦及心臟基因表達譜的影響。方法:七氟烷預處理大鼠后，DNA微陣列法檢測大鼠肝、腦及心臟基因表達差異，qRT-PCR驗證其中三個差異表達的基因。結果:根據(jù)事先制定的數(shù)據(jù)處理標準，2％的七氟烷預處理90分鐘后，所有組織表現(xiàn)出基因表達差異。在這些表達差異的基因里有34個基因在至少兩個組織中呈現(xiàn)同一方向的表達變化，其中19個上升，

2、15個下降。本研究選取了三個在肝臟中表達有影響的三個基因進行qRT-PCR試驗，qRT-PCR實驗結果與DNA微陣列結果一致。結論:鑒別了34種在大鼠肝腦心臟經(jīng)七氟烷預處理后表達差異的基因。
　　第二章金屬硫蛋白Ⅰ+Ⅱ在七氟烷預處理原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元過程中的作用
　　目的:探討七氟烷延遲預處理在大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元中的保護特性及金屬硫蛋白Ⅰ+Ⅱ(Metallothionein，MT-Ⅰ+Ⅱ)在麻醉延遲預處理介導的保護作用中的

3、作用機制。
　　方法:1）原代神經(jīng)元培養(yǎng);2）七氟烷預處理;3）建立體外氧一葡萄糖剝奪模型;4)qRT-PCR檢測MT-Ⅰ+Ⅱ mRNA表達水平;5）乳酸脫氫酶(LDH)檢測神經(jīng)元毒性;6）微管相關蛋白-2/膠質(zhì)纖維酸性蛋白檢測神經(jīng)元毒性;7）免疫熒光檢測MTⅠ+Ⅱ的神經(jīng)元中的定位情況;8)siRNA抑制MTⅠ+Ⅱ的表達;9）外源MTⅠ+Ⅱ蛋白轉染。
　　結果:1）1.5％七氟烷預處理3小時組缺糖缺氧后(Oxygen-Glu

4、eose Deprivation OGD)在任一時間點對神經(jīng)元毒性明顯小于沒有預處理組(P＜0.05)。七氟烷預處理對OGD誘導的神經(jīng)元損傷的保護作用在24小時時是11.7±8.2％(n=22);保護作用在72小時時達到頂峰37.5％±4.3％(n=22);在96小時時保護作用仍然有31.9％±5.2％;n=29）。2）OGD3小時對神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)都有毒性作用，但是神經(jīng)元的毒性作用更大，其生存率是39.6±7.8％，而神經(jīng)膠質(zhì)在OGD

5、3h后生存率是80.2±10.5％。但是七氟烷預處理組，神經(jīng)元存活率恢復至85.3±9.2％，存活率上升程度超過125％，而神經(jīng)膠質(zhì)存活率上升程度只有22％。對神經(jīng)元進行兩因素方差分析表明，OGD和七氟烷預處理(APC)的主效應顯著(P＜0.01)，且交互作用顯著(P＜0.01)。方差分析表明七氟烷預處理能夠有效抵抗OGD介導的神經(jīng)元死亡作用，OGD組和APC+OGD組兩組間T檢驗也有差異，P＜0.01，也能證實這一結果。神經(jīng)膠質(zhì)的兩因

6、素方差分析結果則發(fā)現(xiàn)OGD和七氟烷預處理的主效應顯著(P＜0.05)，但兩組間交互作用無差異(P=0.53)，這說明七氟烷預處理不能保護神經(jīng)膠質(zhì)拮抗OGD介導的損傷作用。3）外源性MTⅠ+Ⅱ蛋白轉染原代培養(yǎng)的神經(jīng)元后，3小時OGD處理，LDH釋放實驗結果表明與對照組相比（轉染胰島素氧化β鏈），MTⅠ+Ⅱ對GD誘導的神經(jīng)元損傷的保護作用從3.1±1.4％(轉染1.6μM MTⅠ+Ⅱ，P＞0.05，n=10)上升至34.8±9.2％(轉染3

7、.2μM MTⅠ+Ⅱ,P＜0.001,n=10)。4) MTImRNA表達水平在預處理12小時后達到峰值，為未處理組的2.2±0.8倍，在預處理后6、12小時與未處理組表達有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);MTⅡ mRNA表達水平在預處理12小時后達到峰值，為未處理組的2.9±1.1倍，在預處理后3、6、12小時與未處理組表達有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。5)無義siRNA轉染對七氟烷預處理保護原代神經(jīng)元作用影響不大，為19.4±3.5％。

8、兩因素方差分析表明，MTⅠ+Ⅱ基因沉默(P＜0.05)和七氟烷預處理(P＜0.01)主效應顯著，但兩者間交互作用無統(tǒng)計學意義(P=0.564)，這表明部分抑制MTⅠ+Ⅱ基因表達并不能有效降低七氟烷預處理拮抗OGD介導神經(jīng)元損傷作用。但是在未預處理對照組，與轉染無義siRNA相比，轉染MT-Ⅰ+Ⅱ siRNA顯著加重了OGD處理對神經(jīng)元的損傷作用，這表明細胞MT-Ⅰ+Ⅱ水平低于正常水平時，OGD更加容易引起神經(jīng)元損傷。6)與源自未經(jīng)預處理

9、的鼠原代神經(jīng)元相比，源自經(jīng)預處理的大鼠原代神經(jīng)元能夠有效對抗OGD誘導的神經(jīng)元損傷(22.5±3.4％; n=16，P＜0.05)。7)單克隆MTⅠ+Ⅱ主要分布于MAP2標記的神經(jīng)元。
　　結論:1）建立經(jīng)七氟烷處理后金屬硫蛋白Ⅰ+Ⅱ時間變化表。2）在麻醉劑延遲預處理過程中，神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞都得到保護。3）神經(jīng)元既能容易遭受葡萄糖剝奪引起的損傷，這一損傷作用又更容易受到缺血預處理作用的保護。4）基因敲除研究表明金屬硫蛋白參

10、與了七氟烷介導的延遲預處理過程。5）直接轉染外源性金屬硫蛋白，表明金屬硫蛋白是預防缺血性損傷的有效手段。
　　第三章金屬硫蛋白Ⅰ+Ⅱ作為氧化應激傳感器在七氟烷預處理保護過程中的作用機制
　　目的:探討了經(jīng)吸入麻醉劑七氟烷、活性氮類一氧化氮及超氧化自由基預處理之后，金屬硫蛋白作為氧化應激傳感器發(fā)揮作用的機制。
　　方法:1）原代神經(jīng)元培養(yǎng);2）七氟烷預處理;3）體外氧—葡萄糖剝奪模型的建立;4）乳酸脫氫酶(LDH)檢測神

11、經(jīng)元毒性;5）神經(jīng)元核蛋白提取;6）Western blot檢測MTF-1的表達。
　　結果:1）200μM SNAP預處理能夠顯著提高神經(jīng)元拮抗OGD損傷，保護率為（38.2±2.9％;n=28），與未經(jīng)預處理組相比有統(tǒng)計學差異(p＜0.001;n=28)。同樣濃度的SNAP經(jīng)37℃，24小時降解處理后再預處理神經(jīng)元，結果表明SNAP降解后，保護率顯著降低只有7.9±4.1％(n=14)，與對照組無統(tǒng)計學差異(P=0.4)，與未

12、降解SNAP有統(tǒng)計學差異(p＜0.01;n=14)。巴拉刈(yi)預處理能夠顯著提高神經(jīng)元拮抗OGD損傷，保護率為（23.8±6.2％;n=14），與未經(jīng)預處理組相比有統(tǒng)計學差異(p＜0.01;n=14)。為了確保拮抗OGD損傷的保護作用只是來自相應的預處理，在OGD處理評價細胞毒性實驗前，更換神經(jīng)元培養(yǎng)基。LDH實驗結果表明SNAP、巴拉刈及降解型SNAP與正常對照組相比，LDH水平差異不大，分別是正常組的(75.2±2.6％，p=0

13、.18，n=6)、(82±3.1％; p=0.26，n=6)及(65.5±1.1％;p＜0.05; n=6)。SNAP、巴拉刈預處理后2小時，與未預處理組相比，MTF-1核定位分別提高了74±18％和224±85％;n=3，），而降解型SNAP預處理對提高MTF-1核定位程度不明顯，只有16±5.8％;n=3，)。2)與未預處理相比，2.5％七氟烷預處理2小時對神經(jīng)元拮抗4小時OGD處理損傷作用的保護率為(31.6±3.4％;p＜0.0

14、01;n=15)。在七氟烷預處理前，用0.1mM誘導性一氧化氮抑制劑氨基胍（aminoguanidine，AG）或者1.0mM過氧化物歧化酶Mn-TBAP(mimetic manganese(Ⅲ) tetrakis(4-benzoic acid) porphyrin chloride)干預2小時后，七氟烷預處理對神經(jīng)元拮抗OGD誘導損傷作用的保護率分別下降至5.4±3.7％(p=0.47; n=18)、6.2±4.1％(p=0.28;n

15、=14)。Western blot實驗表明，七氟烷預處理后與對照組比較，MTF-1核定位程度增加了53±1.8％(p＜0.001;n=3)。而在氨基胍和Mn-TBAP干預組，MTF-1核定位增加程度分別為-6.2±3.9％(n=3)和17±4.2％(n=3)。3)七氟烷、SNAP及巴拉刈預處理對MT-Ⅰ+Ⅱ基因敲除的神經(jīng)元拮抗OGD誘導損傷的保護率分別為(0.75±0.2％;n=22;p=0.80),(-1.43±0.9％; n=24,

16、p=0.66),and(-5.8±3.2％; n=14,p=0.31)。LDH釋放實驗檢測證實單獨預處理對MT-Ⅰ+Ⅱ基因敲除的神經(jīng)元毒性作用不明顯，單獨七氟烷、SNAP及巴拉刈預處理的神經(jīng)毒性作用分別為:(13±7.9％;n=8; p=0.27)、(-4.0±1.5％;n=8;p=0.57; n=8)及（9±4.0％;n=8; p=0.21），差異均無統(tǒng)計學差異。Western結果表明，七氟烷、SNAP及巴拉刈預處理組MT-Ⅰ+Ⅱ基因

17、敲除的神經(jīng)元細胞核中MTF-1的表達水平分別高出對照組3.0±9.7％，18±3.0％，and31±2.7％(n=3)。
　　結論:1.在麻醉劑延遲預處理過程中，阻止NO或者過氧化物的產(chǎn)生，降低了保護作用和MTF-1的核定位;2.NO和過氧化物激動劑單獨作用也產(chǎn)生對神經(jīng)元培養(yǎng)物的保護作用，也相應增加了MTF-1的核定位;3.將金屬硫蛋白Ⅰ+Ⅱ的基因敲除，不但能夠降低由NO和過氧化物介導的保護作用，同時也能降低七氟烷預處理介導的核內(nèi)