慢速冷凍及復(fù)蘇后培養(yǎng)時(shí)間對(duì)人類卵母細(xì)胞紡錘體和染色體影響的研究.pdf

1、目的 (1)通過(guò)小鼠成熟卵母細(xì)胞慢速冷凍實(shí)驗(yàn)，探討冷凍液中不同的蔗糖濃度對(duì)小鼠成熟卵母細(xì)胞冷凍效果的影響；探討不同體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)小鼠復(fù)蘇后的卵母細(xì)胞受精和胚胎發(fā)育情況的影響；初步試驗(yàn)輔助激活方法補(bǔ)救復(fù)蘇后單精子卵胞漿內(nèi)顯微注射(ICSI)受精失敗的卵母細(xì)胞的可行性。(2)通過(guò)人成熟卵母細(xì)胞的慢速冷凍實(shí)驗(yàn)，比較冷凍液中不同的蔗糖濃度對(duì)人類卵母細(xì)胞慢速冷凍效果的價(jià)值；(3)采用免疫熒光染色方法，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察人類成熟卵母細(xì)

2、胞冷凍前后、復(fù)蘇后不同時(shí)間內(nèi)紡錘體和染色體形態(tài)學(xué)變化；探討冷凍和體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)人類卵母細(xì)胞第二次減數(shù)分裂時(shí)期紡錘體和染色體的影響，為人類成熟卵母細(xì)胞凍融方法的改進(jìn)和后期發(fā)育結(jié)局的改善提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 (1)30只清潔級(jí)成年健康昆明小白鼠，進(jìn)行控制性超促排卵(COH)后獲取小鼠成熟卵母細(xì)胞，比較冷凍液中不同蔗糖濃度(0.2mol/l蔗糖vs0.3mol/l蔗糖)的冷凍效果；(2)復(fù)蘇后存活良好的卵母細(xì)胞培養(yǎng)不同的時(shí)間(

3、1h、2h、3h、4h、5h)行ICSI，觀察受精和胚胎發(fā)育情況；比較新鮮和解凍后ICSI受精失敗的卵母細(xì)胞采用Ca<'2+>載體離子霉素聯(lián)合嘌呤霉素輔助激活的效果。(3)人成熟卵母細(xì)胞 124枚隨機(jī)分為兩組行慢速程序化冷凍，冷凍液中分別采用 0.2mol/l 蔗糖和0.3mol/l蔗糖，了解兩組凍融后的存活情況；(4)兩組存活良好、外觀形態(tài)正常的64枚卵母細(xì)胞，隨機(jī)分為3組，分別體外培養(yǎng)不同的時(shí)間(1h、3h、5h)，后固定熒光染色，

4、同時(shí)用18枚新鮮的人成熟卵母細(xì)胞熒光染色作為對(duì)照組，在激光共聚焦顯微鏡下觀察紡錘體和染色體的形態(tài)。 結(jié)果 (1)0.2mol/l蔗糖組和0.3mol/l蔗糖組相比，小鼠成熟卵母細(xì)胞凍融后存活率分別為60.5％、80.7％，兩組相比有顯著差異性(P<0.05)；復(fù)蘇后小鼠卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)不同的時(shí)間(1h、2h、3h、4h、5h)，結(jié)果顯示培養(yǎng)3h、4h組的卵母細(xì)胞正常受精率、囊胚形成率和培養(yǎng)1h、2h組結(jié)果相比有明顯差異(

5、p<0.05)；3h、4h 兩組之間正常受精率和囊胚形成率相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)；培養(yǎng)1h、2h兩組結(jié)果相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)；培養(yǎng)5h組中部分卵母細(xì)胞ICSI前已經(jīng)發(fā)生卵裂，其剩余卵母細(xì)胞正常受精率和囊胚形成率和其它組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)；幾組正常受精后的胚胎卵裂率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。采用 Ca<'2+>載體離子霉素聯(lián)合嘌呤霉素輔助激活解凍后ICSI受精失敗的卵母細(xì)胞，凍融組卵母細(xì)胞激活率明

6、顯低于新鮮組(30.4％vs71.1％，p <0.05)，凍融組有一枚激活的卵母細(xì)胞發(fā)育至囊胚。(2)人成熟卵母細(xì)胞采用慢速程序冷凍方法，冷凍液中采用0.2mol/l蔗糖和0.3mol/l蔗糖，存活率分別為56.5％、80.6％，兩組相比有明顯差異性(P<0.01)。復(fù)蘇后存活良好的人卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)不同的時(shí)間(a組：1h、b組：3h、c組：5h)固定熒光染色，三組凍融后的卵母細(xì)胞紡錘體正常比例明顯低于對(duì)照組新鮮卵母細(xì)胞(10.0％vs

7、 83.3％,P<0.05；45.5％vs 83.3％，P<0.05；40.9％vs83.3％，P<0.05)；a組紡錘體的缺失率明顯高于對(duì)照組(45.0％vs 5.6％，p<0.5)。在凍融后的卵母細(xì)胞中，a組分別和b組、c組相比，紡錘體正常比例明顯下降(10.0％vs 45.5％，p<0.05；10.0％vs 40.9％，P<0.05)；紡錘體缺失率明顯增高(45.5％vs 13.6％，p<0.05；45.5％vs 13.6％，P<

8、0.05)。b、c兩組紡錘體觀察結(jié)果相比無(wú)明顯差異。a組與b組、c組和對(duì)照組三組相比，正常染色體率明顯降低(30.0％vs 68.2％,p<0.05；30.0％vs 63.6％，P<0.05；30.0％vs 77.8％，P<0.05)。b組、c組、對(duì)照組三組染色體觀察結(jié)果相比，無(wú)明顯差異(p>0.05)。 結(jié)論 (1)慢速冷凍小鼠成熟卵母細(xì)胞，CPA中0.3mol/l蔗糖較0.2mol/l蔗糖可以明顯提高凍融后卵母細(xì)胞存

9、活率；復(fù)蘇后的小鼠卵母細(xì)胞ICSI前培養(yǎng)3～4h可以提高正常受精、胚胎分裂能力。用Ca<'2+>載體離子霉素聯(lián)合嘌呤霉素的輔助激活方法，可能會(huì)使復(fù)蘇后受精失敗的卵母細(xì)胞獲得正常受精和繼續(xù)發(fā)育的希望，但由于凍融過(guò)程對(duì)卵母細(xì)胞的損傷，與ICSI受精失敗的新鮮卵母細(xì)胞相比，復(fù)蘇后受精失敗的卵母細(xì)胞被補(bǔ)救激活的能力明顯下降。(2)慢速冷凍人類成熟卵母細(xì)胞，適當(dāng)提高CPA中蔗糖濃度同樣可以明顯提高存活率；采用免疫熒光染色和激光共聚焦顯微技術(shù)(CL