RUNX3及其甲基化在人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及調(diào)節(jié)因素的初步研究.pdf

1、背景 胃癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，與人類其余腫瘤一樣，是多基因、多因素及多階段的綜合病變的結(jié)果。有證據(jù)表明胃癌的發(fā)生與抑癌基因突變或者異常表達(dá)有一定的相關(guān)性。近期研究顯示DNA異常甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)沉默是抑癌基因失活的另一機(jī)制，屬于表觀遺傳學(xué)范疇，在胃癌發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。RUNX3基因是新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，屬于RUNX轉(zhuǎn)錄因子家族，位于人染色體lp36．1。近期研究發(fā)現(xiàn)其參與調(diào)節(jié)脊神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)發(fā)育和T淋

2、巴細(xì)胞的分化，并可通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B（TGF-β)信號(hào)途徑調(diào)節(jié)胃粘膜上皮的增殖和凋亡。 目的 (1)．檢測(cè)不同分化程度的胃癌細(xì)胞株中RUNX3mRNA表達(dá)以及甲基化狀態(tài)。 (2)．觀察RUNX3甲基化的胃癌細(xì)胞株在去甲基化處理前后其生物學(xué)特性、對(duì)化療藥敏感性以及TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感性方面的變化，為胃癌的發(fā)生機(jī)制和聯(lián)合治療提供理論依據(jù)。 方法 采用RT-PCR法檢測(cè)四種不同分化程度的胃癌細(xì)胞

3、株中RUNX3mRNA表達(dá)，并采用不同濃度的去甲基化劑5一氮雜脫氧胞苷(5-AZA-dC)處理細(xì)胞株，觀察處理前后RUNX3mRNA表達(dá)水平的變化情況，同時(shí)結(jié)合甲基化敏感性聚合酶聯(lián)鏈反應(yīng)（MSP)研究人胃癌細(xì)胞中RUNX3基因的甲基化狀態(tài)；并對(duì)RUNX3甲基化的細(xì)胞采用5-AZA-dC去甲基化處理，采用四甲基偶氮唑鹽法(MTT法)和流式細(xì)胞儀觀察去甲基化處理前后的胃癌細(xì)胞株在生物學(xué)特性、對(duì)化療藥氟尿嘧啶(5一FU)的敏感性以及對(duì)TGF-

4、B誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡敏感性的變化。 結(jié)果 (1)．采用RT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)四株不同分化程度的人胃癌細(xì)胞株SGC7901(中分化)、MKN45(低分化)和BGC823(未分化)均見RUNX3mRNA表達(dá)，而MKN28(高分化)中RUNX3mRNA表達(dá)缺失。 (2)．采用五種不同濃度5一AZA—dC(O．1um01／L、10mol／L、3umol／L、5um01／L以及10umol／L)處理胃癌細(xì)胞株72h后，SGC79

5、01、BGC823和MKN45細(xì)胞中，RUNX3mRNA干預(yù)前后無(wú)明顯變化；而MKN28細(xì)胞中，在終濃度為10umol／L的5一AZA-dC條件下，可檢測(cè)出RUNX3mRNA表達(dá)。MSP結(jié)果顯示，表達(dá)RUNX3mRNA的胃癌細(xì)胞株SGC7901、MKN45及BGC823由非甲基化引物擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，而甲基化引物未能擴(kuò)增出相應(yīng)產(chǎn)物；MKN28僅由甲基化引物擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，但經(jīng)10umol／L的5-AZA-dC處理后的MKN28僅出現(xiàn)非甲基

6、化引物擴(kuò)增的產(chǎn)物。 (3)．去甲基化劑5一AZA-dC逆轉(zhuǎn)MKN28細(xì)胞中RUNX3基因表達(dá)，處理后應(yīng)用完全培養(yǎng)液連續(xù)傳代五代，RT-PCR仍可檢測(cè)出基因的表達(dá)。 (4)．5-AZA-dC處理后的MKN28生長(zhǎng)速度顯著慢于對(duì)照組。不同濃度的5一FU對(duì)5-AZA—dC處理后的MKN28的生長(zhǎng)抑制率要顯著高于未經(jīng)5一AZA～dC處理組(P<0．05)。 (5)．TGF-p1誘導(dǎo)5-AZA—dC處理前后的MKN28細(xì)胞

7、的早期凋亡隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)而增加(P<0．05)；在48h和72h，TGF-β1聯(lián)合5-AZA-dC誘導(dǎo)MKN28細(xì)胞凋亡的作用優(yōu)于兩者單純相加，具有協(xié)同作用(P