RUNX3基因甲基化修飾及其下游AKT信號(hào)通路在人肺腺癌化療耐藥表型中的作用研究.pdf

1、肺癌目前是世界上最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類健康。近年來，肺癌的發(fā)病率和死亡率呈急劇上升的態(tài)勢(shì)。在北美，肺癌的5年生存率僅為15％，我國則更低。肺癌通常分為小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，在NSCLC中，肺腺癌發(fā)病率上升明顯，在許多國家已超過鱗狀細(xì)胞癌成為最常見的肺癌組織類型。肺癌起病非常隱匿，約3/4的患者在初診的時(shí)候就已經(jīng)發(fā)生了晚期轉(zhuǎn)移，手術(shù)的機(jī)會(huì)受到了很大的限制，因此化療仍然是肺癌臨床治療的重要手段之一。雖然

2、在過去的二十余年對(duì)肺癌的生物遺傳學(xué)行為的研究有了很大的進(jìn)展，但至今仍然沒有很有效的方法可以治愈肺癌?；熌退幍拇嬖谌匀恢萍s著肺癌治療取得進(jìn)一步效果。大多數(shù)患者的死因與耐藥之間存在著直接或者間接的關(guān)系，如何逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性將是提高腫瘤化療效果的關(guān)鍵。隨著第三代化療藥物的應(yīng)用，NSCLC的化學(xué)治療有了很大進(jìn)步。多西紫杉醇(docetaxel，多西他賽)是第三代化療藥物中的代表藥物之一，它的前體是從歐洲紫杉針葉中提取，經(jīng)半合成而獲得，其作

3、用機(jī)理主要是促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)微管雙聚體聚合，從而形成穩(wěn)定的微管聚合物，抑制其解聚，使游離的微管數(shù)量顯著減少，從而抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂和增殖，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，具有較高的抗腫瘤活性。但與其他化療藥物一樣，耐藥現(xiàn)象的存在限制了其有效應(yīng)用。然而，有關(guān)多西他賽的耐藥機(jī)制，國內(nèi)外研究尚不充分。本課題組前期首先通過逐漸增加藥物濃度在體外誘導(dǎo)篩選出對(duì)多西他賽耐藥的肺腺癌細(xì)胞株(SPC-A1/DTX，H1299/DTX)，并觀察了耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞(SPC

4、-A1，H1299)之間的生物學(xué)特性差異。隨后，通過cDNA表達(dá)芯片與甲基化芯片的分析，我們最終篩選出RUNX3與多西他賽化療藥物敏感性相關(guān)，并進(jìn)行深入的研究。體外功能實(shí)驗(yàn)表明，SPC-A1/DTX和H1299/DTX細(xì)胞中RUNX3過表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯并增加多西他賽化療敏感性;而SPC-A1和H1299細(xì)胞中抑制RUNX3表達(dá)則起到相反效果。通過建立移植瘤動(dòng)物模型，腹腔注射多西他賽，來觀測腫瘤的生長，

5、結(jié)果進(jìn)一步表明瘤內(nèi)穩(wěn)定高表達(dá)RUNX3可以明顯增強(qiáng)多西他賽的化療敏感性。通過定制的Realtime-PCR芯片，我們發(fā)現(xiàn)以上結(jié)果可能的機(jī)制為RUNX3能夠抑制AKT信號(hào)通路的激活，并經(jīng)共轉(zhuǎn)染Akt1持續(xù)活化質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。臨床標(biāo)本中的結(jié)果也表明，肺腺癌組織RUNX3表達(dá)與Akt1呈負(fù)相關(guān)，且RUNX3高表達(dá)提示患者采用含多西他賽輔助化療方案的無病生存期(DFS)較短?？傊呒谆T導(dǎo)的RUNX3下調(diào)可能通過對(duì)AKT信號(hào)通路的活化參與肺腺

6、癌多西他賽耐藥機(jī)制，RUNX3基因可望成為肺腺癌多西他賽化療敏感性的預(yù)測指標(biāo)及逆轉(zhuǎn)耐藥的潛在靶點(diǎn)。
　　 第一部分人肺腺癌耐多西他賽細(xì)胞株與親本細(xì)胞株的cDNA表達(dá)與甲基化芯片差異
　　 目的:探討肺腺癌耐藥細(xì)胞系(SPC-A1/DTX)與親本細(xì)胞系(SPC-A1)中基因表達(dá)差異與啟動(dòng)子甲基化差異譜。
　　 方法:借助上海伯豪生物技術(shù)有限公司Affymetrix cDNA芯片服務(wù)平臺(tái)對(duì)SPC-A1/docetax

7、el和親本SPC-A1細(xì)胞進(jìn)行cDNA差異表達(dá)譜進(jìn)行篩選（重復(fù)三次），經(jīng)過濾條件篩選到的數(shù)據(jù)進(jìn)行SAM分析，篩選出cDNA差異表達(dá)譜，并通過Realtime-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)依托臺(tái)灣華聯(lián)生物科技有限公司(PhalanxBiotech Group)高通量DNA甲基化芯片篩選平臺(tái)技術(shù)對(duì)SPC-A1/docetaxel和親本SPC-A1細(xì)胞進(jìn)行DNA甲基化差異譜進(jìn)行篩選（重復(fù)三次），經(jīng)過濾條件篩選到的數(shù)據(jù)進(jìn)行SAM分析，篩選出DNA甲基化

8、差異表達(dá)譜，并通過MSP進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果:耐藥細(xì)胞系(SPC-A1/DTX)中，從cDNA表達(dá)芯片數(shù)據(jù)中篩選出基因表達(dá)下降最明顯的有:SERPINB5（60.9倍），LUM（57.3倍），ING4（39.4倍），CYP1A1(33.8倍),RASIP1(24.5倍),SFRP1(24.15),RNASEK(22.1倍),TMPRSS11F(20.4倍)，GALR2（18.7倍），KRT15（18.5倍），RUNX3（17.

9、8倍），ABCG2（17.1倍），ABCC3（16.5倍）。甲基化芯片數(shù)據(jù)顯示甲基化發(fā)生率(△_beta＞0.8)的有FOXO1A(0.952),ADAM33(0.915), CEBPA(0.897), SFRP1(0.882),FLNC(0.873), DAPK1(0.862), SNX9(0.842), MATN2(0.831), NAP1L5(0.819), STAP2(0.816), ADAM12(0.807), HOXD11(

10、0.806), F2R(0.804),TAPBPL(0.803)，MMP14(0.802)，RUNX3(0.801)。最終發(fā)現(xiàn)兩個(gè)芯片有一個(gè)共同基因:RUNX3。MSP和Realtime-PCR芯片證實(shí)RUNX3基因在 SPC-A1/DTX中發(fā)生高甲基化且表達(dá)明顯下調(diào)。
　　 結(jié)論:啟動(dòng)子甲基化誘導(dǎo)的RUNX3基因表達(dá)下調(diào)很有可能參與了肺腺癌細(xì)胞SPC-A1/DTX的多西他賽耐藥，有望為肺腺癌多西他賽化療提供有價(jià)值的分子標(biāo)記物，

11、并為逆轉(zhuǎn)其耐藥表型提供潛在的分子治療靶點(diǎn)。
　　
　　 第二部分 RUNX3在肺腺癌中的體內(nèi)與體外的功能分析
　　 目的:利用體內(nèi)、外模型，從細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期等方面驗(yàn)證RUNX3參與調(diào)節(jié)人肺腺癌細(xì)胞多西他賽化療敏感性。
　　 方法:通過MTT法和Realtime-PCR檢測不同濃度5-Aza-dc處理48小時(shí)后SPC/DTX、H1299/DTX細(xì)胞對(duì)多西他賽的IC50及RUNX3的基因表達(dá)改變;

12、通過合成RUNX3基因表達(dá)載體(N-eGFP-RUNX3)和RNA干涉載體(pGPU-shRUNX3)并分別轉(zhuǎn)染人肺腺癌SPC-A1/DTX、H1299/DTX，SPC-A1、H1299細(xì)胞，人為改變細(xì)胞內(nèi)RUNX3表達(dá)水平，MTT法測定細(xì)胞對(duì)多西他賽敏感性差異;克隆形成實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞體外增殖能力差異;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡率差異。將SPC-A1/DTX分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對(duì)照(NC-eGFP)和(RUNX3-eGFP)后建立裸鼠皮下移植

13、瘤模型，成瘤后定時(shí)給予多西他賽腹腔注射并繪制腫瘤生長曲線，適時(shí)處死動(dòng)物后取瘤體組織，免疫組化染色檢測RUNX3、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）陽性率差異。
　　 結(jié)果:10μM5-Aza-dc處理SPC/DTX、H1299/DTX細(xì)胞后，其對(duì)于多西他賽的IC50值顯著下降，RUNX3未甲基化比例明顯升高，RUNX3表達(dá)明顯升高。在SPC-A1/DTX和H1299/

14、DTX細(xì)胞中人為上調(diào)RUNX3表達(dá)水平后，細(xì)胞對(duì)多西他賽敏感性顯著提高(P＜0.01)，細(xì)胞體外增殖能力下降(P＜0.01)，細(xì)胞早期凋亡率增加(P＜0.01)，細(xì)胞周期G1期顯著阻滯（P＜0.01）及G2/M期減少(P＜0.01);相反，在SPC-A1和H1299細(xì)胞中人為下調(diào)RUNX3表達(dá)水平后，細(xì)胞對(duì)多西他賽敏感性顯著降低(P＜0.05)，SPC-A1細(xì)胞體外增殖能力下降(P＜0.05)，細(xì)胞周期G1期減少(P＜0.05)并出現(xiàn)G

15、2/M期增加(P＜0.05)。在裸鼠移植瘤模型中，人為上調(diào)RUNX3表達(dá)水平并給予多西他賽化療可協(xié)同抑制SPC-A1/DTX細(xì)胞的成瘤能力，顯著增加腫瘤細(xì)胞對(duì)多西他賽治療的反應(yīng)性，并誘導(dǎo)瘤體組織內(nèi)PCNA表達(dá)降低，提示細(xì)胞增殖能力受阻。
　　 結(jié)論:小劑量5-Aza-dc可能通過去除RUNX3啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，上調(diào)RUNX3基因表達(dá)而部分逆轉(zhuǎn)SPC-A1/DTX和H1299/DTX細(xì)胞對(duì)多西他賽的化療耐藥。RUNX3可在體內(nèi)、外

16、對(duì)肺腺癌細(xì)胞產(chǎn)生顯著的多西他賽化療增敏作用，同時(shí)伴有細(xì)胞增殖受阻、凋亡增加，以及細(xì)胞周期分布的明顯變化。
　　
　　 第三部分RUNX3對(duì)下游AKT信號(hào)通路的作用
　　 目的:進(jìn)一步探討RUNX3參與調(diào)節(jié)人肺腺癌細(xì)胞多西他賽化療敏感性的可能機(jī)制。
　　 方法:將RUNX3基因表達(dá)載體(NC-eGFP)和（RUNX3-eGFP）分別轉(zhuǎn)染人肺腺癌耐藥細(xì)胞系(SPC-A1/DTX)，使用常州楚天生物有限公司定

17、制腫瘤表達(dá)譜PCR芯片應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR同時(shí)對(duì)腫瘤信號(hào)通路相關(guān)的88個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)分析。芯片包含了與細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡，DNA修復(fù)，血管的形成以及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的相關(guān)一系列基因。發(fā)現(xiàn)Akt/GS3Kβ/β-catenin信號(hào)通路為RUNX3下游多西他賽耐藥主要相關(guān)信號(hào)通路。通過RUNX3基因過表達(dá)載體（RUNX3-eGFP）與持續(xù)活化AKT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SPC-A1/DTX細(xì)胞，人為逆轉(zhuǎn)RUNX3過表達(dá)對(duì)耐藥細(xì)胞株的影響，Western bl

18、ot檢測Akt/GS3Kβ/β-catenin下游末端靶分子的蛋白表達(dá)。對(duì)人類肺腺癌親本細(xì)胞株(SPC-A1)使用AKT抑制劑（MK-2206），MTT法測定細(xì)胞對(duì)多西他賽敏感性差異;克隆形成實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞體外增殖能力差異;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡率差異。選取39例使用過包含多西他賽化療方案的肺腺癌術(shù)后腫瘤組織樣本，通過免疫組化檢測組織中RUNX3和AKT表達(dá)情況，采用Kaplan-Meier生存曲線分析患者生存。
　　 結(jié)果

19、:在人肺腺癌耐藥細(xì)胞系(SPC-A1/DTX)中過表達(dá)RUNX3后，Akt1，p-AKT,p-GSK3β，β-catenin，CyclinD1，bcl-2，bcl-xl蛋白表達(dá)顯著下降，而p21，Bax則顯著上升，而共轉(zhuǎn)染持續(xù)活化Akt質(zhì)粒則可逆轉(zhuǎn)RUNX3過表達(dá)引起的上述改變。在人類肺腺癌親本細(xì)胞系(SPC-A1)中通過抑制AKT信號(hào)通路，顯著增加細(xì)胞對(duì)多西他賽的敏感性(p＜0.01)，抑制細(xì)胞增殖能力(p＜0.05)，有效阻滯G1期

20、(p＜0.01)并減少G2/M期(p＜0.01)，但細(xì)胞早期凋亡率無明顯變化(p＞0.05)。在肺腺癌臨床組織樣本中，RUNX3的表達(dá)水平與Akt1的表達(dá)（Spearman，rho=-0.607，p＜0.01）存在負(fù)相關(guān)，且RUNX3高表達(dá)提示患者無病生存期(Disease Free Survival, DFS)不佳(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:RUNX3可以顯著抑制Akt1的表達(dá)和Akt/GS3Kβ/β-catenin信號(hào)通