炎性因子在糖尿病大鼠周圍神經(jīng)修復(fù)再生中的作用及中藥筋脈通對(duì)其影響的研究.pdf

1、[目的]
　　從整體、細(xì)胞及分子水平研究炎性因子在糖尿病大鼠周圍神經(jīng)修復(fù)再生中的作用及中藥筋脈通是否能夠通過(guò)干預(yù)炎性因子途徑減輕神經(jīng)組織損傷、促進(jìn)神經(jīng)再生修復(fù)，從而減少DPN的發(fā)生。
　　[方法]
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　將雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常(Con)組和造模組，造模組采用鏈脲佐菌素(60mg/kg)一次性腹腔注射建立糖尿病大鼠模型。造模成功后隨機(jī)分為糖尿病(DM)組、筋脈通(JMT)組、神經(jīng)妥樂平(Ntp)

2、組，每組各10只。成模后予灌胃給藥，JMT和Ntp組分別按成人劑量15倍給藥，Con組和DM組則給予等量蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃16周，測(cè)量大鼠機(jī)械痛閾值，采用免疫組化、ELISA、WesternBlot等方法觀察DPN大鼠坐骨神經(jīng)組織中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α等炎性因子及NGF、NT-3等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)以及中藥筋脈通的干預(yù)作用。
　　2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　采用組織貼塊法體外培養(yǎng)乳鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞(SCs)

3、，設(shè)置正常對(duì)照組（25mmol/L葡萄糖）及50、75、100mmol/L不同濃度葡萄糖的條件培養(yǎng)基，采用CCK-8法摸索高糖對(duì)SCs的最佳作用時(shí)間和最宜作用濃度:分別加入普通培養(yǎng)基、正常鼠血清培養(yǎng)基、高糖培養(yǎng)基(Glu)、筋脈通(JMT)和神經(jīng)妥樂平(Ntp)含藥血清進(jìn)行培養(yǎng)，探索筋脈通含藥血清對(duì)高糖條件下SCs活性的影響;ELISA法檢測(cè)不同干預(yù)條件下SCs上清液中IL-6、TNF-α、NGF的含量;Western Blot法檢測(cè)S

4、Cs中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α及NGF、NT-3蛋白的表達(dá)。
　　[結(jié)果]
　　第一部分:
　　1.血糖和體重:與Con組相比，各造模組大鼠血糖均升高(P＜0.05)。藥物干預(yù)后，治療組血糖在同一時(shí)間點(diǎn)與DM組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，治療組間血糖在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。造模后各組大鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。給藥4周后，DM組與Con組相比體重下降(P＜0.05)

5、;給藥8、12、16周各造模組與Con組相比體重下降(P＜0.05)，各造模組組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　2.機(jī)械痛閾值:與Con組相比，DM組的左右足機(jī)械痛閾值均降低(P＜0.05)，糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)模型成功建立。
　　3.ELISA法檢測(cè)DPN大鼠血清中IL-6、TNF-α、NGF的含量:
　　(1) IL-6、TNF-α:與Con組相比，各組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量均升高(P＜0

6、.05);與DM組相比，JMT組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量均降低(P＜0.05)，Ntp組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05);與Ntp組相比，JMT組IL-6、TNF-α含量均降低(P＜0.05)。
　　(2)NGF:與Con組相比，DM組、JMT組大鼠血清中NGF含量減少(P＜0.01、P＜0.05);與DM組相比，各治療組均升高，差異具有顯著性意義(P＜0.01);JMT組較Ntp組血清中NGF含量減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

7、P＜0.01)。
　　4.免疫組化法檢測(cè)DPN大鼠坐骨神經(jīng)中NT-3的表達(dá):
　　與Con組相比，DM組大鼠坐骨神經(jīng)NT-3的IOD值下降(P＜0.05);與DM組相比，JMT組、Ntp組大鼠坐骨神經(jīng)NT-3的IOD值升高(P＜0.05);JMT組與Ntp組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　5.Western Blot檢測(cè)坐骨神經(jīng)IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、NGF、NT-3蛋白的表達(dá):
　　

8、(1) IL-1β、IL-10:與Con組相比，DM組IL-1β、IL-10蛋白表達(dá)增加(P＜0.05);與DM組相比，JMT組IL-1β、IL-10蛋白表達(dá)減少(P＜0.05);JMT組與Ntp組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　(2) IL-6:各組IL-6蛋白表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);
　　(3) TNF-α:與Con組相比，DM組TNF-α蛋白表達(dá)增加(P＜0.05);與DM組相比，JMT組、Ntp組

9、TNF-α蛋白表達(dá)減少(P＜0.05);JMT組與Ntp組TNF-α蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　(4) NGF:與Con組相比，DM組NGF蛋白表達(dá)減少(P＜0.05);與DM組相比，JMT組NGF蛋白表達(dá)增加(P＜0.05);與Ntp組相比，JMT組NGF蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)。
　　(5) NT-3:與Con組相比，DM組NT-3蛋白表達(dá)減少(P＜0.05);與DM組相比，JMT組NT-3蛋白表達(dá)增

10、加(P＜0.05);JMT組與Ntp組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　第二部分:
　　1.成功培養(yǎng)乳鼠坐骨神經(jīng)SCs，經(jīng)鑒定純度可達(dá)90％以上。
　　2.CCK-8比色法檢測(cè)絀胞活性:
　　(1)糖濃度的選擇:隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各濃度葡萄糖組對(duì)SCs活性的抑制作用最早于48h時(shí)產(chǎn)生，50mM Glu組、75mM Glu組、100mM Glu組均表現(xiàn)出較為明顯的抑制作用，故選擇48h、50 mMGlu作為最佳作

11、用時(shí)間和最適糖濃度。
　　(2)筋脈通含藥血清對(duì)高糖條件下SCs活性的影響:與正常對(duì)照組相比，正常鼠血清組、JMT組的絀胞相對(duì)活性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，50mM Glu組細(xì)胞相對(duì)活性下降(P＜0.01)，Ntp組細(xì)胞相對(duì)活性亦有所下降(P＜0.05);與50mMGlu組比較，JMT組細(xì)胞相對(duì)活性升高(P＜0.01)，Ntp組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);與Ntp組相比，JMT組細(xì)胞相對(duì)活性升高(P＜0.01)。
　

12、　3.ELISA法檢測(cè)SCs上清液中IL-6、TNF-α、NGF的含量:
　　(1) IL-6:各組SCs上清液中IL-6含量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);
　　(2) TNF-α:與Con組相比，Glu組SCs.上清液中TNF-α含量增加(P＜0.05);與Glu組相比，JMT組SCs上清液中TNF-α含量降低(P＜0.05);與Ntp組相比，JMT組SCs上清液中TNF-α含量降低(P＜0.05)。
　　(3)

13、NGF:與Con組相比，Glu組SCs上清液中NGF含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05):與Glu組相比，JMT組與Ntp組SCs上清液中NGF含量均升高(P＜0.05)。
　　4.Western Blot檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、NGF、NT-3蛋白表達(dá):
　　(1) IL-1β:與Con組相比，Glu組IL-1β蛋白表達(dá)增加(P＜0.05);與Glu組相比，JMT組IL-1β蛋白表達(dá)減少(

14、P＜0.01);與Ntp組相比，JMT組IL-1β蛋白表達(dá)減少(P＜0.05)。
　　(2) IL-6:各組IL-6蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);
　　(3) IL-10:與Con組相比，Glu組、Ntp組IL-10蛋白表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05);與Glu組相比，JMT組IL-10蛋白表達(dá)減少(P＜0.01);與Ntp組相比，JMT組IL-10蛋白表達(dá)減少(P＜0.01)。
　　

15、(4) TNF-α:與Con組相比，Glu組TNF-α蛋白表達(dá)增加(P＜0.05);與Glu組相比，JMT組TNF-α蛋白表達(dá)減少(P＜0.05);JMT組與Ntp組TNF-α蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　(5) NGF:與Con組相比，Glu組、Ntp組NGF蛋白表達(dá)降低(P＜0.01);與Glu組相比，JMT組NGF蛋白表達(dá)增加(P＜0.05);與Ntp組相比，JMT組NGF蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)。

16、　　(6) NT-3:與Con組相比，Glu組NT-3蛋白表達(dá)減少(P＜0.05);與Glu組相比，JMT組NT-3蛋白表達(dá)增加(P＜0.05);JMT組與Ntp組NT-3蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　[結(jié)論]
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　(1)一次性腹腔注射STZ(60mg/kg)建立DM大鼠模型，16周測(cè)定DM大鼠機(jī)械痛閾值降低，DPN大鼠模型成功建立;(2) DPN大鼠坐骨神經(jīng)組織中IL-1β、IL-10

17、、TNF-α蛋白表達(dá)及血清中IL-6、TNF-α含量均明顯增加，表明炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子參與了DPN的發(fā)生發(fā)展;(3)中藥筋脈通能夠降低DPN大鼠坐骨神經(jīng)組織中IL-1β、IL-10、TNF-α蛋白表達(dá)及血清中IL-6、TNF-α含量，具有減輕炎癥反應(yīng)的作用;同時(shí)能夠明顯增加坐骨神經(jīng)組織中NGF、NT-3表達(dá)。其中在改善血清中IL-6、TNF-α分泌和增加坐骨神經(jīng)中NGF蛋白表達(dá)方面，作用優(yōu)于Ntp組。(4)筋脈通具有改善DPN大鼠周圍神

18、經(jīng)組織損傷的作用，干預(yù)炎癥反應(yīng)及促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌可能是其發(fā)揮作用的重要途徑之一。
　　2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　(1)采用組織貼塊法原代培養(yǎng)SD乳鼠坐骨神經(jīng)SCs，純化后經(jīng)S-100蛋白免疫組化鑒定，純度可達(dá)90％以上。(2)高糖(50mmol/L)培養(yǎng)雪旺細(xì)胞48h時(shí)，對(duì)其活性具有明顯抑制作用。JMT含藥血清可顯著提高高糖條件下SCs的活性，作用優(yōu)于Ntp組。(3)高糖培養(yǎng)條件下SCs上清液中TNF-α含量及SCs中IL-1β

19、、IL-10、TNF-α蛋白表達(dá)均有所增加，提示高糖刺激了SCs產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和炎癥因子;(4)中藥筋脈通能夠降低SCs上清液中TNF-α含量及SCs中IL-1β、IL-10、TNF-α蛋白表達(dá);同時(shí)能夠明顯增加SCs中NGF、NT-3表達(dá)。其中在改善SCs上清液中TNF-α分泌、減少SCs中IL-1β及IL-10蛋白表達(dá)和增加SCs中NGF蛋白表達(dá)方面，優(yōu)于Ntp組。
　　[創(chuàng)新點(diǎn)]
　　目前，炎癥因子在糖尿病周圍神經(jīng)病變中