外源性一氧化碳對小腸缺血再灌注大鼠多器官損傷的作用及機制探討.pdf

1、小腸缺血再灌注(ⅡR，intestinal ischemia-reperfusion)不僅見于腸部疾病，還多與嚴重創(chuàng)傷、大手術(shù)、失血性休克、燒傷和嚴重感染等過程的發(fā)生與發(fā)展相伴隨，是臨床常見的病理生理現(xiàn)象。腸缺血可以導(dǎo)致腸道屏障功能受損，而再灌注過程在補充能量和糾正氧供的同時，還能促使大量原存在于腸腔內(nèi)的細菌和內(nèi)毒素隨血液循環(huán)移位，嚴重時能通過激發(fā)全身性炎癥反應(yīng)(SIRS)而損傷遠隔器官，最終導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(MODS)形成。

2、 通過建立大鼠ⅡR模型，在確定外源性應(yīng)用CO安全性的基礎(chǔ)上，觀察ⅡR不同階段應(yīng)用不同濃度CO對組織超微結(jié)構(gòu)、細胞因子形成、細胞凋亡等的影響，并從細胞和分子水平探討其可能的作用機制，為臨床防治ⅡR所致MODS的發(fā)生和發(fā)展提供新的參考。本研究分為三個部分：一、外源性一氧化碳對小腸缺血再灌注大鼠血中碳氧血紅蛋白的影響；二、外源性一氧化碳對小腸缺血再灌注大鼠多器官損傷的防治作用；三、外源性一氧化碳對小腸缺血再灌注大鼠多器官損傷防治作用的機

3、制探討。 實驗材料: 1、實驗動物：健康雄性Wistar大鼠64只，體重220～260g。 2、實驗試劑和藥品：標(biāo)準(zhǔn)一氧化碳氣體(壓力：9.0MPa，濃度：250×10<'-6>/100×10<'-6>，空氣平衡)；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒；放免法TNF-α與IL-10檢測試劑盒；p38 MAPK抗體；二抗；電泳用聚丙烯酰胺及Tris、甘氨酸等。 3、實驗器材：CIBA-CORNING238型血

4、氣分析儀；Detax壓力監(jiān)測儀；日立H-600-4型透射式電子顯微鏡，8800型超薄切片機，Olympus ML2000型顯微鏡，NIKON 80IFL-FUW-PF型熒光顯微鏡等。 實驗方法 一、動物模型制作大鼠實驗前禁食12h，自由飲水。采用腸系膜上動脈(SMA， Superior Mesenteric Artery)夾閉-開放方式復(fù)制ⅡR模型。大鼠腹腔注射20％烏拉坦(1.0g·kg<'-1>)麻醉，開放股靜脈持續(xù)

5、微泵輸注乳酸鈉林格氏液(10ml·kg<'-1>·h<'-1>)。行頸動脈置管(用于測定動脈壓及采血)，氣管切開插管后接帶單向活瓣T型管(活瓣能保證吸入氣為所需氣體，呼出氣進入大氣)，保留自主呼吸。 二、實驗分組 大鼠隨機分為8組，每組8只。A組：假手術(shù)對照組，不阻斷SMA，其余手術(shù)過程同其他組；B組：小腸缺血再灌注組。經(jīng)T型管吸入空氣。C組分為C1亞組與C2亞組，缺血前10min 開始經(jīng)T型管吸入濃度分別為100ppm

6、、250ppm的CO；D組：分為D1亞組與D2亞組，再灌注開始時經(jīng)T型管吸入濃度為100ppm、250ppm的CO；E組：分為E1亞組與E2亞組，再灌注60min時開始經(jīng)T型管吸入濃度為100ppm、250ppm的C0。 三、觀察指標(biāo)和方法 1、連續(xù)監(jiān)測動脈壓(MAP)變化； 2、血氣值及血中碳氧血紅蛋白(COHb)值； 3、組織超微結(jié)構(gòu)檢查(電鏡)； 4、組織多形核中性粒細胞(PMN)計數(shù)(光鏡

7、)；一 5、組織凋亡細胞計數(shù)(TUNEL免疫熒光法)； 6、血漿TNF-α濃度(放免法)； 7、血漿IL-10濃度(放免法)； 8、組織中p38 MAPK的蛋白表達(Western blot法)。 實驗結(jié)果: 一、外源性CO對ⅡR大鼠血中COHb的影響 1、與A組比較，ⅡR各組再灌注后MAP均明顯下降(P<0.05)；與B組比較，應(yīng)用CO各組MAP變化不明顯(P>0.05)。 2、

8、A組各時點、B組ⅡR前后各時點COHb濃度無明顯差異(P>0.05)。 3、與B組相應(yīng)時點比較，應(yīng)用CO各組COHlb濃度升高(P<0.05)，且250ppm組升高更顯著(P<0.01)。 二、外源性CO對ⅡR大鼠多器官損傷的防治作用(一)組織超微結(jié)構(gòu)的變化： 1、腸：A組見正常小腸結(jié)構(gòu)。B組結(jié)構(gòu)受損極重，小腸上皮大量微絨毛脫落，細胞之間細胞連接松弛，細胞胞質(zhì)內(nèi)大部分線粒體嵴溶解；胞質(zhì)有局部溶解，細胞核內(nèi)異染色質(zhì)

9、邊集，核胞間隙增寬。外源性應(yīng)用CO各組：C1、C2兩組受損較輕，雖胞質(zhì)內(nèi)線粒體外膜模糊不近于正常，但小腸上皮表面微絨毛部分整齊，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)僅輕度擴張；E1、E2兩組受損相對較重。C、D、E組內(nèi)兩亞組比較無明顯差異。 2、肺：A組結(jié)構(gòu)基本正常。B組結(jié)構(gòu)明顯受損，氣血屏障模糊增厚，Ⅱ型上皮細胞表面微絨毛短小稀疏，核型不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)多個線粒體空泡變性，板層小體排空式消失；Ⅰ型上皮細胞部分破損溶解，血管內(nèi)皮細胞大面積溶解，腔內(nèi)見紅細胞。

10、外源性應(yīng)用CO各組：C1、C2兩組受損較輕，Ⅱ型細胞表面微絨毛較完整，部分線粒體完好，多個板層小體存在；而E1、E2兩組受損相對較重。C、D、E組內(nèi)兩亞組比較無明顯差異。 3、肝：A組結(jié)構(gòu)基本正常。B組結(jié)構(gòu)略受損，細胞核膜模糊，異染色質(zhì)邊集，胞質(zhì)部分溶解，部分線粒體外膜破損。外源性應(yīng)用CO各組肝組織結(jié)構(gòu)均受損較輕，細胞核核型較不規(guī)則，少量線粒體外膜有破損。 C、D、E各組間及組內(nèi)兩亞組比較無明顯差異。 4、腎：A組結(jié)構(gòu)正

11、常。B組結(jié)構(gòu)受損輕微，僅見腎小管上皮細胞核核形不規(guī)則及存在大小不等的溶酶體和大的吞飲泡增多。腎小球足突少部分融合。外源性應(yīng)用CO各組腎組織結(jié)構(gòu)均接近正常，腎小管上皮微絨毛較完整、核形規(guī)則；腎小球基膜連續(xù)，薄厚較均勻，足突有局部的融合。 (二)組織中凋亡細胞計數(shù)： 1、腸：B組可見大量凋亡細胞(52±6)。C、D、E各組明顯少于B組(P<0.01)，但多于A組(5±2)(P<0.05)；且C組

12、0.05)；各組內(nèi)亞組數(shù)目有差異，1組均多于2組(P<0.05)。 2、肺：B組可見大量凋亡細胞(32±2)。C、D、E各組明顯少于B組(P<0.01)，但多于A組(2±1)(P<0.05)；且C組

13、N計數(shù)： 1、腸：B組可見大量PMN聚集(66±6)。C、D、E各組明顯少于B組(P<0.01)，但多于A組(26±2)(P<0.05)；且C組

14、內(nèi)亞組雖1組多于2組，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。 3、肝：B組可見PMN聚集(35±3)。C、D、E各組少于B組(P<0.01)，但多于A組(13±1)(P<0.05)；且C組0.05)。 (二)血漿TNF-α濃度的變化： 1、與對照組A組(

15、1.15±0.04)比較，單純ⅡR的B組TNF-α(3.15±0.05)明顯升高(P<0.05)。 2、外源性應(yīng)用CO的C、D、E組TNF-α濃度均明顯低于單純ⅡR的B組(P<0.05)，且C組

16、4.94)升高(P<0.05)。 2、外源性應(yīng)用CO的C、D、E組IL-10濃度均明顯高于單純ⅡR的B組(P<0.05)，且C組>D組>E組(P<0.05)。 3、C、D、E各組內(nèi)亞組比較，2組均高于1組(P<0.05)。 (四)各組織中p38 MAPK蛋白的表達： 1、與對照組A組比較，單純ⅡR的B組p38 MAPK蛋白表達升高(P<0.05)； 2、外源性應(yīng)用CO的C、D、E組p38 MAPK

17、蛋白表達均明顯高于單純ⅡR的B組(P<0.05)，且C組>D組>E組(P<0.05)。 3、C、D、E各組內(nèi)亞組比較，2組均高于1組(P<0.05)。 結(jié)論: 1、大鼠在ⅡR過程中吸入濃度為100ppm/250ppm的CO是安全的。 2、外源性CO對大鼠ⅡR所致多器官損傷具有防治作用，且濃度為250ppm的CO比100ppm的CO作用更明顯；缺血前應(yīng)用比缺血及再灌注后應(yīng)用作用更明顯。 3、外源性C