一氧化碳對腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其新機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下四個方面展開論述：
　　第一部分 一氧化碳釋放分子對小鼠可逆性腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　目的：探討一化碳釋放氧分子CORM-2對小鼠可逆性腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。
　　方法：建立小鼠原位腎缺血再灌注損傷模型，在環(huán)境溫度32℃下完全阻斷小鼠左腎血流40分鐘，然后恢復(fù)其血流灌注，同時切除小鼠對側(cè)腎臟。于術(shù)前1小時靜脈給予CORM-2(20 mg/kg)或已完全釋放CO的iCORM-2。取再灌注24小

2、時后的全血血漿檢測腎功能和腎臟標(biāo)本行HE染色檢查，評價其腎臟組織損傷程度。另外，取再灌注1、3、7天后全血血漿，檢測肌酐和尿素氮水平評價其腎功能變化情況，并通過對小鼠腎臟標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測，觀察小鼠腎功能恢復(fù)過程中炎癥反應(yīng)的變化情況。
　　結(jié)果：小鼠腎臟經(jīng)歷熱缺血再灌注后出現(xiàn)明顯腎功能損害（IRI組 vs. sham組，P<0.05），然而，于術(shù)前1小時靜脈給予CORM-2治療后，小鼠腎臟經(jīng)歷熱缺血40分鐘，再灌注

3、24小時，肌酐和尿素氮升高水平明顯降低，腎功能得到顯著保護(hù)，與假手術(shù)組相比無顯著差異（CORM-2組vs. Sham組P>0.05），與IRI組、iCORM-2組相比有顯著差異（CORM-2組 vs. IRI組，CORM-2組 vs. iCORM-2組，P<0.05）。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，熱缺血再灌注損傷可以破壞腎臟中腎小管上皮細(xì)胞并最終發(fā)生凋亡壞死。CORM-2治療顯著減輕腎小管上皮細(xì)胞的凋亡壞死，從而保護(hù)了腎功能。小鼠腎臟經(jīng)歷熱缺血

4、再灌注損傷后，腎臟組織中出現(xiàn)大量MPO陽性中心粒細(xì)胞，介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)。MPO陽性中性粒細(xì)胞主要出現(xiàn)在灌注后早期，第3天浸潤最多，到灌注第7天MPO陽性中性粒細(xì)胞浸潤逐漸減少。小鼠腎缺血再灌注損傷腎臟組織中浸潤的淋巴細(xì)胞主要是CD3、CD8陽性T淋巴細(xì)胞，出現(xiàn)在灌注后期第7天。CORM-2治療組MPO陽性中性粒細(xì)胞浸潤明顯減少（CORM-2組vs. IRI組、iCORM-2組， P<0.0），到灌注后期第7天T淋巴細(xì)胞浸潤也被明顯抑制。

5、免疫熒光檢查也顯示TNF-α參與了缺血再灌注損傷中的炎癥反應(yīng)，主要出現(xiàn)在早期灌注第1天和第3天，CORM-2治療顯著減少了組織中TNF-α的產(chǎn)生。
　　結(jié)論：CORM-2通過顯著減輕了小鼠腎缺血再灌注中的炎癥反應(yīng)從而發(fā)揮保護(hù)功能。
　　第二部分 一氧化碳釋放分子對小鼠致死性腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　目的：探討一氧化碳釋放分子 CORM-2對小鼠致死性腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。
　　方法：建立小鼠致死性腎缺

6、血再灌注損傷模型，在環(huán)境溫度32℃下完全阻斷小鼠左腎血流50分鐘，然后恢復(fù)其血流，同時切除小鼠對側(cè)腎臟，觀察小鼠存活情況。于術(shù)前1小時靜脈給予一氧化碳釋放分子CORM-2治療。并取再灌注24小時的全血血漿，檢測肌酐和尿素氮水平評價其腎功能情況。另外，取再灌注24小時的腎臟標(biāo)本行 HE、TUNEL、CD31免疫熒光染色檢查評價腎臟組織損傷程度。通過免疫組織化學(xué)和實(shí)時定量 PCR檢測炎性細(xì)胞浸潤及炎性因子產(chǎn)生情況，觀察小鼠腎缺血再灌注損傷中

7、炎癥反應(yīng)程度。
　　結(jié)果：小鼠腎臟經(jīng)歷50分鐘熱缺血再灌注后，出現(xiàn)嚴(yán)重缺血再灌注損傷，并最終導(dǎo)致小鼠死亡。缺血前1小時給予CORM-2治療可以顯著抑制小鼠的腎IRI死亡，所有小鼠全部存活。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，腎臟的缺血再灌注損傷嚴(yán)重破壞了腎小管上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，并最終發(fā)生凋亡壞死。CORM-2治療顯著保護(hù)了上述兩種細(xì)胞的完整性，并減少其發(fā)生凋亡壞死，從而保護(hù)了腎功能。另外，損傷腎臟組織中廣泛出現(xiàn)大量MPO陽性中心粒細(xì)胞浸

8、潤，介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)。CORM-2治療組中MPO陽性中性粒細(xì)胞浸潤明顯減少（CORM-2組vs. IRI組、iCORM-2組，P<0.05）。實(shí)時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)IRI腎組織中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6等mRNA表達(dá)上調(diào)。免疫熒光檢查也顯示 TNF-α參與了缺血再灌注損傷中的炎癥反應(yīng)， CORM-2治療顯著抑制了炎性因子mRNA表達(dá)上調(diào)，減少了組織中TNF-α的產(chǎn)生。
　　結(jié)論：一氧化碳釋放分子CORM-2通過釋放

9、CO可以發(fā)揮顯著的腎臟保護(hù)作用，抵御致死性的小鼠腎缺血再灌注損傷。
　　第三部分 一氧化碳釋放分子對致死性IRI的保護(hù)作用與其顯著抑制HMGB1釋放有關(guān)
　　目的：探討一氧化碳釋放分子CORM-2在小鼠缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用與腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞HMGB1遷移釋放的關(guān)系。
　　方法：建立小鼠致死性腎臟缺血再灌注損傷模型，檢測腎臟缺血后組織中危險因子HMGB1的變化及遷移釋放，同時檢測給予CORM-2治療對腎IRI中HMGB

10、1遷移釋放的影響。分離原代小鼠腎小管上皮細(xì)胞體外低氧培養(yǎng)，通過免疫熒光和免疫共沉淀檢測細(xì)胞中HMGB1的遷移釋放和乙?；揎?，以及CORM-2治療對HMGB1遷移釋放和乙?；揎椀挠绊?。另外，Western Blot和免疫共沉淀檢測原代小鼠腎小管上皮細(xì)胞經(jīng)H2O2氧化應(yīng)激損傷刺激后HMGB1的遷移釋放和乙?；揎棧o予CORM-2治療探討其發(fā)揮的保護(hù)作用及其效應(yīng)的機(jī)制。
　　結(jié)果：在小鼠腎臟缺血損傷早期，腎臟上皮細(xì)胞大量 HMGB

11、1從胞核遷移至胞漿并釋放至循環(huán)，從而啟動的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡壞死。而缺血前1小時給予CORM-2治療可以明顯減少HMGB1的核漿遷移釋放。病理及Western Blot檢測顯示缺血損傷后，腎小管上皮細(xì)胞核中HMGB1明顯釋放，CORM-2治療后腎小管上皮細(xì)胞核中HMGB1釋放不明顯（CORM-2組vs. IRI組，P＜0.05）。原代小鼠腎小管上皮細(xì)胞在低氧和 H2O2刺激實(shí)驗(yàn)中，大量HMGB1出現(xiàn)核漿遷移，免疫熒光和

12、免疫共沉淀檢測分別顯示 CORM-2治療可以顯著抑制原代小鼠腎小管上皮細(xì)胞經(jīng)低氧或 H2O2刺激損傷后 HMGB1的遷移釋放和乙?；揎棧瑥亩Ｗo(hù)腎小管上皮細(xì)胞抵御低氧或氧化應(yīng)激損傷。
　　結(jié)論：在缺血再灌注損傷早期，CORM-2可以顯著減少腎小管上皮細(xì)胞中 HMGB1乙?；揎?，抑制HMGB1核漿遷移釋放，從而阻斷炎癥反應(yīng)，減輕缺血再灌注損傷。
　　第四部分 一氧化碳釋放分子對小鼠缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與腎組織HO-1表

13、達(dá)的關(guān)系
　　目的：探討一氧化碳釋放分子CORM-2在小鼠腎缺血再灌注損傷中的保護(hù)效應(yīng)與組織HO-1表達(dá)的關(guān)系。
　　方法：應(yīng)用CORM-2、iCORM-2或CoPP預(yù)處理，在不同時間點(diǎn)檢測小鼠腎臟組織中的HO-1表達(dá)水平，并以此為依據(jù)建立腎臟缺血再灌注損傷模型，并觀察不同不同預(yù)處理對腎臟的保護(hù)效應(yīng)。取缺血再灌注損傷后24小時血漿檢測Cr和BUN水平，并收集腎臟標(biāo)本行HE、TUNEL、CD31免疫熒光、MPO免疫組化和TNF

14、-?免疫熒光檢測，評價腎臟損傷和炎癥反應(yīng)程度。
　　結(jié)果：免疫組化及Western Blot檢測顯示CORM-2、iCORM-2以及CoPP給藥24小時后明顯上調(diào)腎小管上皮HO-1表達(dá)水平，但對致死性的腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用有限。CORM-2給藥1小時，腎小管上皮細(xì)胞HO-1上調(diào)表達(dá)不明顯，而CORM-2術(shù)前1小時給藥明顯減輕腎缺血再灌注損傷，保護(hù)腎功能（vs.IRI組、CORM-2-24h組、iCORM-2-24h組和CoP