一氧化碳對脂多糖所致大鼠腸道損傷的作用及機制研究.pdf

1、腸道是人體一個與外界相連通的器官，是獲得各種營養(yǎng)素的主要器官，同時，腸道也發(fā)揮了免疫、屏障、代謝和內(nèi)分泌等重要功能。并且，腸道還是是機體內(nèi)最大的細(xì)菌存儲基地，而同時又是除皮膚以外隔絕機體內(nèi)、外環(huán)境的最主要屏障。腸道以其獨特的生理環(huán)境及生理功能參與了危重病病理生理過程。感染、休克、和嚴(yán)重的創(chuàng)傷等，可以導(dǎo)致腸粘膜水腫、糜爛和潰瘍形成，腸道蠕動減弱或者消失；同時腸道內(nèi)的微生態(tài)環(huán)境平衡受到破壞，腸道內(nèi)細(xì)菌和毒素排泄障礙，腸道菌群失調(diào)，條件致病菌

2、大量繁殖，產(chǎn)生大量的毒素并侵入體內(nèi)組織器官和循環(huán)系統(tǒng)。導(dǎo)致全身白細(xì)胞系統(tǒng)持續(xù)激活，同時釋放大量炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，使系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)加劇、失調(diào)，這些病理過程是多器官功能障礙綜合征(MODS)主要病理環(huán)節(jié)。 MODS的病理生理過程中，腸道既是受損的“靶”器官，同時亦是造成機體進(jìn)一步損傷的“激發(fā)”器官。腸道內(nèi)含有大量的G-細(xì)菌和脂多糖，而脂多糖在MODS時機體的各種反應(yīng)中發(fā)揮了觸發(fā)的作用。脂多糖可以刺激免疫系統(tǒng)和血管內(nèi)皮系統(tǒng)中的炎癥效

3、應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì)，其中主要的有促炎和抗炎細(xì)胞因子，這些促炎和抗炎因子之間相互作用，形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)以及許多正負(fù)反饋環(huán)，導(dǎo)致了“炎癥瀑布效應(yīng)”，從而加重了機體的損傷。 1988年，Mashall等提出了MODS的“胃腸道學(xué)說”，認(rèn)為消化道是MODS的啟動點。一般認(rèn)為，當(dāng)G-細(xì)菌和脂多糖移位進(jìn)入循環(huán)和組織中，主要通過它們的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)而使機體發(fā)生膿毒癥，并導(dǎo)致MODS的發(fā)生。移

4、位進(jìn)入循環(huán)和組織中的脂多糖與原位的感染灶一樣，其LPS可以強有力的刺激細(xì)胞因子的合成和釋放，并觸發(fā)膿毒癥和MODS的形成。 在機體遭受感染時，循環(huán)功能開始代償，內(nèi)臟血管首先出現(xiàn)選擇性收縮，以保證腦、心等重要生命器官的血液灌注。胃腸道粘膜血管首先出現(xiàn)收縮并供血不足，發(fā)生缺血性損傷和改變。而胃腸粘膜中含有豐富的黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)，腸道缺血后再灌注，可以發(fā)生缺血再灌注后的自由基損傷，腸道組織中可出現(xiàn)過量的超氧化物而引起損傷。LPS使腸道

5、組織損傷，細(xì)胞凋亡增加。中性粒細(xì)胞在受到LPS的刺激后，發(fā)生“呼吸爆發(fā)”，LPS使p38絲裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinase，p38MAPK)的激活，可能是調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞(PMN)“呼吸爆發(fā)”的一個重要機制。 雖然對內(nèi)毒素血癥、膿毒癥、SIRS以及MODS時的腸道治療進(jìn)行了多方探索，抗生素的更新、生命支持和臟器替代治療的改進(jìn)，但對LPS所致的膿毒血癥和多臟器功能障礙的腸道損害仍無

6、有效的治療方法?？咕乜蓺⑺狼秩霗C體的細(xì)菌，但對細(xì)菌的LPS所致的損傷仍無有效治療方法。且細(xì)菌死亡、裂解后釋放更多的LPS，反可使臨床癥狀加重。LPS誘發(fā)產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子對組織細(xì)胞的損害遠(yuǎn)超過LPS本身對機體的直接損害，因而尋找有效的對抗脂多糖血癥的制劑，成為當(dāng)今研究的熱點。但由于脂多糖血癥時，腸道損傷機制復(fù)雜，細(xì)胞因子種類較多，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相互交織，再灌注以及自由基損傷等，尋求一種對于機體或者組織有多種調(diào)控作用的物質(zhì)，需要綜合評價其在脂

7、多糖血癥的全身性病理生理狀態(tài)的作用，以通過這種相對理想的物質(zhì)對脂多糖血癥進(jìn)行多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點的作用。 一氧化碳(CO)曾經(jīng)被認(rèn)為是一種毒性物質(zhì)，有強烈的致命性，被認(rèn)為是血液性缺氧(hemichypoxia)的一個常見原因。1968年開始認(rèn)識到，機體內(nèi)的CO是由內(nèi)源性的抗氧化酶血紅素氧合酶(hemeoxygenase-1，HO-1)將血紅素分解而來，同時產(chǎn)生鐵離子和膽紅素，并且HO-1是內(nèi)源性CO產(chǎn)生的限速酶。直到上個世紀(jì)九

8、十年代，隨著一氧化氮(nitrogenmonoxidum,NO)作為一種氣體信使分子的作用被逐漸了解，同樣為氣體小分子的CO，在體內(nèi)的生理作用也逐漸得到重視，CO成為第二種被發(fā)現(xiàn)有病理生理作用的氣體信使分子。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，CO參與了機體內(nèi)許多的生理和病理生理過程，在機體內(nèi)發(fā)揮了重要的抗炎、抗凋亡及抗氧化應(yīng)激作用。研究表明，CO是一種重要的信號分子，可以保護(hù)組織免于多種應(yīng)激造成的損傷。很多動物實驗研究證據(jù)證明CO在特定的條件下，對包括

9、氧超載或者機械通氣造成的肺損傷、膿毒癥、間質(zhì)性肺纖維化以及肺移植后具有一定的治療作用。由于外源性CO主要通過吸入而發(fā)揮作用，因此研究多集中在急性肺損傷方面，對于其在胃腸道方面的作用及機制也已開始進(jìn)行。 內(nèi)源性的CO和外源性的CO在分子結(jié)構(gòu)上相同，但在體內(nèi)的某些作用方面不同：內(nèi)源性CO是血紅蛋白的降解產(chǎn)物，其產(chǎn)生是細(xì)胞水平的，發(fā)揮一種局限性的作用；而外源性CO則是在各種濃度下的一種全身性的作用。研究表明，外源性CO對給予LPS的大

10、鼠發(fā)揮了直接的抗炎作用。也有報道認(rèn)為外源性的CO通過活化可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，可以減輕肺的缺血再灌注損傷和胰腺β細(xì)胞的凋亡[9,10]；通過P38MAPK通路，減輕肝臟缺血再灌注損傷、內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)；通過MAPK和蛋白激酶Bα(Akt)，內(nèi)源性一氧化氮合酶eNOS通路，發(fā)揮了對心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)。 雖有研究證實一氧化碳具有對抗缺血再灌注損傷、抗凋亡、抗炎的特性，但對脂多糖所導(dǎo)致的腸道炎癥性損傷的保護(hù)作用以及其產(chǎn)生保

11、護(hù)的機制，目前仍不清楚。本研究設(shè)計，通過制作大鼠脂多糖損傷模型，給予一定量的外源性的CO，分別從結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)、生化酶學(xué)以及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子的調(diào)控、炎癥通路等分子生物學(xué)幾個方面，對外源性CO對脂多糖損傷的腸道保護(hù)作用進(jìn)行綜合評價，并探討CO對機體的保護(hù)機制。 本研究通過給予大鼠靜脈注射5mg/kg的LPS，成功復(fù)制大鼠LPS損傷模型。并分別給予大鼠2L/min的250ppm的CO吸入，或者大鼠腹腔內(nèi)注射2ml/kg的CO。收集各實

12、驗組標(biāo)本，分別觀察各項指標(biāo)。本研究分別從形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)、生化酶學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)幾個方面，對CO在腸道中的抗炎作用進(jìn)行了綜合觀察，并探討了CO的作用機制。 形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)方面，將留取的大鼠腸道標(biāo)本，經(jīng)過10﹪福爾馬林固定后，常規(guī)包埋、切片、HE染色，光鏡觀察。經(jīng)戊二醛固定的標(biāo)本，按照透射電鏡(TEM)制作常規(guī)，包埋、漂洗、脫水、超薄切片，透射電鏡下觀察。光鏡的組織形態(tài)學(xué)上可以觀察到，通過CO吸入和CO腹腔內(nèi)注射，便脂多糖攻擊的腸

13、道結(jié)構(gòu)相對單純LPS致傷的腸道組織結(jié)構(gòu)要完整，絨毛和微絨毛破壞相對輕微，減輕了脂多糖對腸道的損害，發(fā)揮了對腸道的保護(hù)作用。電鏡觀察的超微結(jié)構(gòu)顯示，外源性的CO使各種細(xì)胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變相對輕微，CO發(fā)揮了對細(xì)胞的保護(hù)作用。 生化酶學(xué)方面，對能反映腸道損傷程度的丙二醛(malonaldehyde,MDA)進(jìn)行了測定，觀察到經(jīng)過外源性CO干預(yù)的大鼠腸道組織內(nèi)的MDA含量比脂多糖組大鼠腸道組織MDA含量明顯降低，說

14、明CO減輕了腸道的損傷。同時，分別針對谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase，GXH-PX)、黃嘌呤氧化酶(xanthineoxidase，XOD)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、過氧化物岐化酶(Superoxidedimutase，SOD)進(jìn)行了檢測。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)作為氧自由基清除劑的SOD，細(xì)胞內(nèi)低分子和酶性清除劑、還原過氧化物的GXH-PX均升高(p＜0.05或P＜0.01)；而作為

15、反映腸組織中中性粒細(xì)胞浸潤程度的MPO和可損傷腸粘膜的XOD的含量降低(p＜0.05或p＜0.01)。說明外源性的CO對脂多糖損傷的腸道發(fā)揮了有效的保護(hù)作用。 同時，應(yīng)用免疫酶聯(lián)吸附法(ELISA)對細(xì)胞因子進(jìn)行了檢測。分別對血小板活化因子(plateletactivatingfactor,PAF)和細(xì)胞間黏附因子-1(intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1)進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種細(xì)胞因

16、子的量均降低(p＜0.05或p＜0.01)，二者生成或者釋放收到抑制。說明一氧化碳對腸道的保護(hù)作用，可能通過對細(xì)胞因于的抑制，減輕了炎癥反應(yīng)。 在細(xì)胞學(xué)方面，應(yīng)用流式細(xì)胞儀對應(yīng)用外源性的CO前后LPS攻擊的大鼠腸道細(xì)胞凋亡率進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)暴露于CO后的LPS致傷的大鼠腸道細(xì)胞凋亡明顯降低，提示CO抑制了腸道細(xì)胞的凋亡(p＜0.05或p＜0.01)；通過抑制細(xì)胞凋亡，防止了腸道的進(jìn)一步損傷。在分子生物學(xué)方面，同時應(yīng)用RT-PCR

17、技術(shù)對HO-1的表達(dá)進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，予外源性的CO可以促進(jìn)HO-1mRNA的表達(dá)，HO-1表達(dá)的增加，使內(nèi)源性的CO生成增加，共同對組織發(fā)揮保護(hù)作用。同時應(yīng)用Westernblot技術(shù)，觀察了炎癥通路P38MAPK的磷酸化變化，發(fā)現(xiàn)CO吸入抑制了腸道內(nèi)P38MAPK通路的激活，而CO腹腔內(nèi)注射活化了MAPK的表達(dá)，而使炎癥反應(yīng)發(fā)生改變。提示外源性的CO通過P38MAPK通路，減輕腸道LPS所導(dǎo)致的損傷，內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)