一氧化碳高壓干燥保存對小鼠供心冷缺血再灌注損傷的影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本課題選用一氧化碳高壓干燥保存這一嶄新的心臟保存方式來保存小鼠離體心臟，以探討這一方法對小鼠供心冷缺血再灌注損傷的保護(hù)作用效果，并研究其相關(guān)作用機(jī)制。
　　方法:選取健康雄性C57BL/6小鼠，通過建立同系小鼠心臟頸部異位移植模型來觀察供心移植后改變。供體鼠選用4-6W C57BL/6小鼠48只，隨機(jī)分為4組(n=12)，即A組:空白對照組，B組:即刻移植組，C組:HTK保存組，D組:CO高壓干燥保存組;受體鼠選用8-10w

2、 C57BL/6小鼠36只，隨機(jī)分為3組(n=12)，分別作為即刻移植組、HTK保存組，CO高壓干燥保存組的受體。
　　供體小鼠處理:4～6w供體組小鼠，麻醉成功后，剪開腹壁，充分暴露下腔靜脈，經(jīng)下腔靜脈注射4℃肝素水1ml(100u/ml)。剪開胸壁及膈肌暴露心臟，經(jīng)下腔靜脈向心臟緩慢注射高鉀停搏液，直至心臟停跳。分離并將心肺聯(lián)合取下。將分離后心肺組織快速放置于盛有4℃冰凍肝素生理鹽水的培養(yǎng)皿中。
　　供心處理:顯微鏡下修

3、整供心，除肺動脈及主動脈外，余各個心臟血管均予結(jié)扎。用彎頭顯微鑷經(jīng)左右心耳小切口進(jìn)入左右心房腔，鈍性分離房間隔，聯(lián)通左右心房。經(jīng)主動脈殘端置管，緩慢逆行灌注保存液（根據(jù)分組不同，空白對照組、即刻移植組、HTK保存組三組供心灌注HTK液，CO高壓干燥保存組供心灌注改良KH液）灌注壓力固定為30cmH20，灌注時間約為2～3min?？瞻讓φ战M供心處理完后馬上取材行相關(guān)檢查;即刻移植組供心處理完后馬上行異位移植手術(shù)移植;HTK保存組供心處理完

4、后置于15ml4℃HTK液中保存24h; CO高壓干燥保存組供心處理完成后，主動脈殘端留置一灌注管，使主動脈開口處于開放狀態(tài)，且冠脈內(nèi)及主動脈殘端留置的灌注管內(nèi)均充滿改良KH液，經(jīng)此處理后供心懸掛于高壓氣體罐中保存(PO2:3.2×101.325 kPa+Pco:0.8×101.325 kPa=4×101.325 kPa)，并將高壓罐放入4℃冰箱24h，注意留意高壓罐的氣壓改變并及時補(bǔ)充不足的氣體。
　　建立同系小鼠心臟頸部異位移

5、植模型:8～10w小鼠作為受體鼠，麻醉滿意之后，沿小鼠右鎖骨中點(diǎn)至右側(cè)頜下縱行剪開頸部皮膚，充分顯露并分離右頸內(nèi)靜脈及頸總動脈，于頸動靜脈遠(yuǎn)端結(jié)扎，近端予顯微血管夾夾閉。采用改良cuff方法，將靜脈殘端穿入靜脈套管后外翻，呈袖套樣套于靜脈套管壁上，并予10-0絲線固定。肝素生理鹽水沖洗靜脈腔，將靜脈腔內(nèi)殘留組織碎片及血栓祛除。同理處理頸總動脈。受體小鼠準(zhǔn)備完畢之后，取出經(jīng)不同保存條件處理后的供心，將其置于含4℃冰生理鹽水的培養(yǎng)皿中進(jìn)行修

6、整。生理鹽水沖洗并排出左右心耳、主動脈及肺動脈內(nèi)氣體，結(jié)扎左右心耳切口，取出主動脈殘端留置的灌注管，修剪主動脈及肺動脈于合適長度。顯微鏡下，將受體鼠帶套管的頸總動脈套于供心主動脈內(nèi)，頸內(nèi)靜脈套于肺動脈內(nèi)，并將主動脈壁及肺動脈壁分別結(jié)扎固定于套管壁上。手術(shù)完畢后，先開放頸靜脈的近心端，再開放頸動脈的進(jìn)心端，開放后觀察供心表面及吻合口是否有滲血及梗阻的情況，并予相應(yīng)處理。開放后觀察供心2h，記錄心臟的復(fù)跳情況、質(zhì)地改變及顏色變化。根據(jù)供心開

7、放后供心搏動情況，記錄供心復(fù)跳率;根據(jù)供心復(fù)灌后收縮強(qiáng)度、顏色及心肌硬度行移植物活力評分，最低0分，滿分5分，分?jǐn)?shù)越高代表心肌活力越好，術(shù)后供心存活時間越長。觀察完畢后，縫皮，受體鼠保溫、獨(dú)籠飼養(yǎng)。
　　術(shù)后供心取樣檢測:除空白對照組小鼠供心處理后即刻取樣檢測外，余三組供心均于移植后24h取樣行相關(guān)檢測。移植后24h，處死受體小鼠，抽血后分離提取血清，檢測血清肌鈣蛋白Ⅰ(TroponinⅠ，TnⅠ)濃度變化;取供心心肌組織，采用蘇

8、木精—伊紅(hematoxylin-eosinstaining，HE)染色法對組織切片進(jìn)行染色，對比四組供心心肌細(xì)胞排列、細(xì)胞間質(zhì)水腫程度、冠脈血管周圍組織改變及炎癥細(xì)胞浸潤程度，缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)檢測凋亡染色陽性心肌細(xì)胞，并于高倍鏡下行凋亡細(xì)胞計數(shù)，計算凋亡指數(shù)，比較各組心肌細(xì)胞凋亡程度，采用行蛋

9、白免疫印跡法(Western-blot，WB)檢測B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma2，Bcl-2)的蛋白表達(dá)水平，從而推斷細(xì)胞凋亡改變的可能原因。
　　結(jié)果：建模成功2h后，于手術(shù)顯微鏡下可見:即刻移植組供心顏色紅潤，搏動強(qiáng)，竇性心律，心室壁柔軟富有彈性，冠脈通暢，未見明顯出血、淤血表現(xiàn)。HTK保存組心臟組織顏色多呈黑紅色、彈性差，心室壁僵硬，多為無搏動或局部心房搏動，心律失常多見，冠脈內(nèi)血流淤滯，冠脈周圍

10、可見彌漫性出血灶，供心多于移植后24h內(nèi)停止搏動。CO高壓干燥保存組:心臟顏色紅稍偏暗，彈性稍差，心室壁稍顯僵硬，搏動多為竇性心律，心肌收縮力較即刻移植組減弱，冠脈內(nèi)血流通暢，冠脈周圍可見少量散在出血點(diǎn)。移植物活力評分結(jié)果:各組移植物活力評分分別用中位數(shù)、第1四分位數(shù)(P25％)及第3四分位數(shù)(P75％)表示，即刻移植組、HTK保存組及CO高壓干燥保存組活力評分分?jǐn)?shù)為5(5～5)、0(0～1)、3(2.25～3.75)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

11、(P＜0.01)。調(diào)整檢驗(yàn)水平α'=α/3=0.0167，行兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，即刻移植組活力評分高于HTK保存組及CO高壓干燥保存組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)，CO高壓干燥保存組評分高于HTK保存組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。各組供心復(fù)跳率結(jié)果為:即刻移植組中有10只、HTK保存組中有2只、CO高壓干燥保存組中有9只供心移植后復(fù)跳(n=12)，復(fù)跳率分別為83.3％、16.7％、75.0％。三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=1

12、3.03，P=0.0015＜0.01）。調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)α'=α/3=0.0167后，行多樣本兩兩比較，CO高壓干燥保存組的復(fù)跳率與即刻移植組的復(fù)跳率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=1＞0.0167)，但明顯高于HTK保存組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0167)。HTK組復(fù)跳率明顯低于即刻移植組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(r2=10.67，P=0.0011＜0.01)。四組血清肌鈣蛋白Ⅰ濃度分別為:空白對照組:(0.28±0.02) ng/ml，即刻移植組:

13、(0.37±0.03) ng/ml，HTK保存組:(2.02±0.05) ng/ml，CO高壓干燥保存組:(1.59±0.04) ng/ml。組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6404.74，P＜0.01)，即刻移植組較空白對照組稍升高(P＜0.001);CO高壓干燥保存組明顯高于即刻移植組(P＜0.001)，但低于HTK保存組(P＜0.001)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。四組供心的HE染色對比發(fā)現(xiàn)，光學(xué)顯微鏡下，空白對照組供心組心肌細(xì)胞染色均一，排

14、列致密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰，間質(zhì)未見水腫，冠脈壁完整，周圍未見明顯紅細(xì)胞滲出;即刻移植組供心心肌組織染色均一，細(xì)胞排列有序，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完成，組織間質(zhì)稍水腫;HTK保存組供心，可見部分心肌細(xì)胞變性，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間可見核深染中性粒細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞間質(zhì)可見紅細(xì)胞滲出;CO高壓干燥保存組:供心心肌細(xì)胞排列致密，結(jié)構(gòu)完整，排列基本規(guī)整，染色較均勻，心肌細(xì)胞較完整，心肌細(xì)胞間質(zhì)可見少量中性粒細(xì)胞侵潤，未見明顯紅細(xì)胞滲出。Tunel檢測顯示，空白

15、對照組心肌細(xì)胞呈均一的淡染，未見異常核。即刻移植組心肌細(xì)胞染色均勻，偶見綠色陽性細(xì)胞，HTK保存組可見大量綠色陽性凋亡細(xì)胞，CO高壓干燥保存組可見少量綠色陽性凋亡細(xì)胞，但明顯少于HTK保存組?？瞻讓φ战M、即刻移植組、HTK保存組及CO高壓干燥保存組凋亡細(xì)胞指數(shù)分別1.08±0.15、3.96±0.41、15.83±1.33、4.21±0.28，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1003.67，P＜0.01)。空白對照組凋亡指數(shù)遠(yuǎn)小于其余三組，差異有

16、統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。即刻移植組凋亡指數(shù)小于HTK保存組(P＜0.01)，但與CO高壓干燥保存組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.44＞0.05)。CO高壓干燥保存組較HTK保存組的凋亡指數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。Western-blot檢測發(fā)現(xiàn):空白對照組、即刻移植組、HTK保存組、CO高壓干燥保存組的Bcl-2蛋白表達(dá)量分別為(0.14±0.01)、(0.18±0.01)、(0.62±0.05)、(0.71±0.

17、05)，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=750.79，P＜0.01)。多樣本間兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，空白對照組Bcl-2蛋白表達(dá)量最低，即刻移植組心肌Bcl-2表達(dá)低于HTK保存組(P＜0.01)及CO高壓干燥保存組(P＜0.01)，CO高壓干燥保存組的心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白高于HTK保存組(P=0.003＜0.01)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：CO高壓干燥保存是一種有效的心臟保存方法。該方法可有效延長小鼠供心離體保存時間，減少離體供心