流行性乙型腦炎病毒SA14-14-2株全基因組序列分析及E蛋白抗原表位鑒定.pdf

1、流行性乙型腦炎(Japanese encephalitis,JE)是由黃病毒科黃病毒屬的乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的一種以蚊蟲為媒介傳播的人和動物共患的病毒性疾病,對人類危害巨大,是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的蟲媒病之一,對豬可引起繁殖障礙,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失.豬是JEV的中間宿主,帶毒豬是本病的主要傳染源.因此,控制豬的JE不僅對養(yǎng)豬業(yè)而且對人類健康都具有十分重要的意義.

2、 本研究首先根據(jù)已發(fā)表的JEV SA14-14-2株基因序列設計合成了4對引物,通過RT-PCR從乙腦病毒SA14-14-2株經(jīng)BHK21細胞傳至第20代的毒株SA14-14-2-B20中擴增得到了覆蓋乙腦病毒基因組全長的4個eDNA片段,將所得片段克隆至pMD18-T載體上,經(jīng)測序和拼接后,獲得了JEV基因組全序列(SA14-14-2-B20).序列分析表明,該JEV基因組全長10 977bp,含有1個大的開放閱讀框架,編碼1個由

3、3 432個氨基酸殘基組成的聚合蛋白,其5'非編碼區(qū)和3'非編碼區(qū)分別由95和583個堿基組成.將此全序列與SA14源病毒株核苷酸、氨基酸進行比較,同源性均在99﹪以上,突變位點分散于各個區(qū)域,而且發(fā)現(xiàn)SA14-14-2-B20一些位點和SA(A)及野毒株SA14核苷酸、氨基酸序列相同而與疫苗株SA14-14-2不同,推測這些區(qū)域可能與減毒沒有關系.發(fā)現(xiàn)SA14-14-2-B20在3'非編碼區(qū)第10 701位插入一個堿基G.比較了31株

4、JEV全序列的3'非編碼區(qū),結(jié)果提示10701位堿基G插入?yún)^(qū)域可能是JEV易變位點.將SA14-14-2-B20序列與GenBank發(fā)表的31株JEV全序列進行同源性分析,以進一步了解JEV之間的遺傳進化關系.本研究所獲得的SA14-14-2-B20株全序列測定,一方面有助于揭示病毒的致病和減毒機理,另一方面也為減毒活疫苗生產(chǎn)的質(zhì)量控制,主要為監(jiān)控可能發(fā)生的回復突變提供分子基礎.此外,病毒基因組全序列cDNA克隆的建立為進一步進行感染性

5、克隆的研究奠定了基礎. E蛋白是JEV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,在病毒的吸附、融合、血凝、細胞趨向性、病毒毒力和誘導保護性免疫反應中起重要作用.本試驗通過PCR擴增EFl(1～291aa)、EF2(292～402 aa)和EF3(403～500 aa)3個片段,PCR產(chǎn)物分別定向克隆到表達載體pGEX-6p-1中,經(jīng)誘導各融合蛋白均以包涵體的形式表達.兔抗SA14-14-2病毒血清的EIASA和Western blot結(jié)果均表明EF1和E

6、F2片段1-402aa是E蛋白的免疫優(yōu)勢決定區(qū).為對這一免疫優(yōu)勢區(qū)域進行抗原表位鑒定,設計一套52個部分重疊的短肽,這些短肽覆蓋全部1-402aa片段.將每一個短肽基因序列分別合成一對寡核苷酸鏈,退火后插入表達載體pGEX-6p-1,與GST進行融合表達,多數(shù)表達的融合蛋白以可溶解的形式存在.用JEV陽性血清進行 Western blot和EIASA掃描,鑒定出11個抗原表位,分別為E1(1～16 aa)、E10(73～88 aa)、E

7、11(81～96 aa)、E19(145～160 aa)、E33(257～272aa)、E39(305～320 aa)、E45(353～368 aa)、E47(369～384 aa)、E48(377～392 aa)、E49(385～400aa)和:E63(373～388 aa).通過Western blot蛋白免疫印記對鑒定的抗原表位進行精細分析,最終確定為9個抗原表位:E1(1～16 aa)、E10-4(77～84 aa)、E11.2

8、(83～94aa)、E19(145～160 aa)、E33(257～272 aa)、E39-2(309～316 aa)、E45-3(359～362 aa)、E48-1(377～384 aa)、E49(385～400aa).應用此9個融合蛋白對小鼠進行免疫,結(jié)果表明9個融合蛋白均能誘導小鼠產(chǎn)生針對短肽的特異性抗體.且通過中和試驗鑒定出E10(73～88 aa)、E39(305～320 aa)為線性中和表位.其中表位E10與現(xiàn)有的報道區(qū)域重