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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:制備雷帕霉素(rapamycin,RAPA,商品名Sirolimus)脂質(zhì)體滴眼液,研究RAPA對(duì)大鼠真菌性角膜炎(fungal keratitis,F(xiàn)K)的治療作用及它對(duì)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(chemotactic protein-1,MCP-1),白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)表達(dá)的影響,探討RAPA治療FK的機(jī)理,為臨床真菌性角膜炎藥物治療提供思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:利用薄膜分散法制備
2、RAPA脂質(zhì)體滴眼液,以正交設(shè)計(jì)法研究制備工藝中影響脂質(zhì)體制備質(zhì)量的主要影響因素,篩選出較理想的處方。將96只健康Wistar大鼠隨機(jī)分為四組:A組正常對(duì)照組6只。B組真菌性角膜炎空白對(duì)照組30只。C組真菌性角膜炎空白脂質(zhì)體對(duì)照組30只。D組真菌性角膜炎R(shí)APA脂質(zhì)體治療組30只。A組大鼠不予處理;B、C、D組大鼠先制備FK動(dòng)物模型,建模成功后:D組RAPA脂質(zhì)體滴眼液滴眼,每天四次,C組空白脂質(zhì)體滴眼液滴眼,每天四次,B組不予特殊處理
3、。每日裂隙燈顯微鏡觀察眼局部情況,并分別于建模后的1d、3d、5d、7d、14d詳細(xì)記錄真菌感染后大鼠角膜反應(yīng)情況,評(píng)分并拍照;同時(shí)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽取各組6只大鼠取材,HE染色及PAS染色行組織病理學(xué)檢查;免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)MCP-1、IL-1β蛋白的表達(dá),計(jì)算機(jī)圖象分析,測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的光密度值;半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(semi-quantitative reverse transcription polymerase chain
4、reaction,RT-PCR)方法檢測(cè)角膜組織MCP-1、IL-1βmRNA的表達(dá)。
結(jié)果:1.制得的RAPA脂質(zhì)體,為完整的類(lèi)球形,平均粒徑為145.2nm,包封率為90.02%,RAPA脂質(zhì)體滴眼液中RAPA含量高,粒徑合適,可作為滴眼液用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。2.裂隙燈顯微鏡檢查可見(jiàn):FK感染后1天,出現(xiàn)角膜水腫渾濁,3天,渾濁加重,蔓延至整個(gè)角膜,中央見(jiàn)潰瘍?cè)睿?天,潰瘍加重,部分穿孔,7天,新生血管形成,開(kāi)始瘢痕愈合。其中,
5、RAPA治療組角膜病變程度減輕,臨床評(píng)分低于空白對(duì)照組及空白脂質(zhì)體對(duì)照組。3.HE染色及PAS染色,HE染色顯示:第1天角膜明顯水腫,少量炎癥細(xì)胞侵潤(rùn),第3天,感染部位角膜結(jié)構(gòu)完全被破壞,出現(xiàn)潰瘍?cè)睿罅康难装Y細(xì)胞侵潤(rùn);第5天,角膜組織變薄,基質(zhì)纖維疏松,炎癥細(xì)胞減少;第7天,纖維細(xì)胞增多,出現(xiàn)機(jī)化,少量炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)。PAS染色結(jié)果顯示:感染后第1天,病灶可見(jiàn)少量菌絲;第3天,見(jiàn)大量的菌絲,第5天,病灶內(nèi)可見(jiàn)少數(shù)幾根菌絲或未找見(jiàn)菌絲;第
6、7天則基本未查見(jiàn)菌絲。RAPA治療組較空白對(duì)照組及空白脂質(zhì)體對(duì)照組角膜病變程度輕,真菌數(shù)量減少。4.正常大鼠角膜上皮細(xì)胞有微弱的MCP-1、IL-1β蛋白的表達(dá);FK感染后,MCP-1、IL-1β蛋白1d開(kāi)始表達(dá)增強(qiáng),3d時(shí)達(dá)高峰,5d開(kāi)始下降,隨后逐漸降低,14d略高于正常。RAPA治療組MCP-1、IL-1β蛋白的表達(dá)被顯著抑制,與FK對(duì)照組及FK空白脂質(zhì)體對(duì)照組相比差異有顯著性(P<0.01)。5.正常大鼠角膜上皮細(xì)胞有微弱的MC
7、P-1、IL-1βmRNA的表達(dá);FK感染后,MCP-1、IL-1βmRNA1d開(kāi)始表達(dá)增強(qiáng),3d時(shí)達(dá)高峰,5d開(kāi)始下降,隨后逐漸降低,14d略高于正常。RAPA治療組MCP-1、IL-1βmRNA的表達(dá)被顯著抑制,與FK對(duì)照組及FK空白脂質(zhì)體對(duì)照組相比差異有顯著性(P<0.01)。
結(jié)論:1.脂質(zhì)體是RAPA良好的藥物載體。
2.FK后角膜病變逐漸進(jìn)展,5天達(dá)高峰,隨后逐漸開(kāi)始減輕,真菌負(fù)荷3天最重,隨后逐漸減少。
8、
3.正常角膜組織有少量MCP-1、IL-1β蛋白及mRNA的表達(dá),F(xiàn)K后它們的表達(dá)增強(qiáng),3d時(shí)達(dá)高峰,5d開(kāi)始下降,隨后逐漸降低,14d略高于正常。
4.RAPA對(duì)真菌性角膜炎有較好的治療作用。
5.RAPA能減少真菌性角膜炎的真菌負(fù)荷。
6.RAPA能顯著抑制MCP-1、IL-1β蛋白、MCP-1、IL-1βmRNA的表達(dá)。
7.RAPA可能是通過(guò)直接抑制真菌及抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用來(lái)發(fā)
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