TREM-1在真菌性角膜炎發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、目的：探討髓樣細(xì)胞表達(dá)的激發(fā)受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)在真菌性角膜炎中的表達(dá)及其作用的分子機(jī)制。
　　方法：分別以真菌性角膜炎患者、真菌性角膜炎動(dòng)物模型為對(duì)象研究TREM-1在機(jī)體中的表達(dá)規(guī)律；體外培養(yǎng)人角膜上皮細(xì)胞，研究TREM-1在真菌感染的人角膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制。實(shí)驗(yàn)分為三部分：（1)選擇2012年9月至2013年10月

2、在青島大學(xué)附屬醫(yī)院眼科就診的真菌性角膜炎初診患者25例（25眼)為患者實(shí)驗(yàn)組，并根據(jù)角膜潰瘍炎癥反應(yīng)程度再分為輕度炎癥組、中度炎癥組和重度炎癥組，收集角膜病灶周邊角膜上皮組織；制作角膜植片后剩余的周邊角膜的健康供體5例＃5眼)為患者對(duì)照組，收集植片外圍角膜緣2mm內(nèi)角膜上皮；RT-PCR檢測(cè)各組角膜上皮中TREM-1的表達(dá)及其與炎癥反應(yīng)程度的關(guān)系。健康Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（角膜未予任何處理）、損傷對(duì)照組（刮除角膜上皮后僅覆

3、蓋角膜接觸鏡，不接種真菌）和真菌感染組（刮除角膜上皮后覆蓋角膜接觸鏡，接種真菌），根據(jù)角膜感染程度進(jìn)行評(píng)分；刮取各組角膜上皮行RT-PCR、Western blot檢測(cè)TREM-1的表達(dá)及其與角膜感染程度的關(guān)系；完整摘除角膜組織，免疫熒光染色檢測(cè)TREM-1在角膜中的定位表達(dá)。（2)體外培養(yǎng)人永生化角膜上皮細(xì)胞，分別加入煙曲霉菌菌絲刺激液、煙曲霉菌孢子刺激液，RT-PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)角膜上皮細(xì)胞中TREM-1的表達(dá)，篩選作用顯著的刺激

4、液，Western blot檢測(cè)該刺激液對(duì)TREM-1蛋白表達(dá)的影響；RT-PCR檢測(cè)不同濃度LP17(TREM-1選擇性抑制劑）預(yù)處理后煙曲霉菌刺激液誘導(dǎo)的角膜上皮細(xì)胞TREM-1表達(dá)改變以及TREM-1阻斷對(duì)煙曲霉菌刺激液誘導(dǎo)的角膜上皮細(xì)胞炎癥因子分泌的影響。（3)研究TREM-1與Toll樣受體-4(Toll like receptor-4，TLR-4)之間的協(xié)同作用，分別使用TREM-1抑制劑LP17、TLR-4抑制劑CLI-0

5、95和MyD88(TLR信號(hào)通路下游因子）抑制劑ST2825預(yù)處理體外培養(yǎng)的人永生化角膜上皮細(xì)胞，Western blot檢測(cè)煙曲霉菌孢子刺激液誘導(dǎo)的TREM_1、TLR_4和MyD88蛋白表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)分別/聯(lián)合抑制TREM-1、TLR-4對(duì)煙曲霉菌孢子刺激液誘導(dǎo)的角膜上皮細(xì)胞炎癥因子分泌的影響。
　　結(jié)果：（1)與對(duì)照組相比，真菌性角膜炎患者輕度炎癥組、中度炎癥組和重度炎癥組中TREM-1 mRNA的表達(dá)均顯著升高，而

6、且隨炎癥程度加重，TREM-1表達(dá)升高越明顯，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（代0.05)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，真菌感染組8h起角膜上皮TREM-1 mRNA表達(dá)量較空白對(duì)照組不斷升高，48h達(dá)到高峰，各時(shí)間點(diǎn)之間差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(代0.001)；16h起，真菌感染組角膜上皮中TRME-1 mRNA的表達(dá)量均明顯高于損傷對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（K0.001);真菌感染組24h、48 h角膜上皮TREM-1蛋白表達(dá)水平隨時(shí)間升高，且均明顯高于空

7、白對(duì)照組(P70.05)；免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組大鼠角膜TREM-1表達(dá)主要位于角膜上皮層，真菌感染組大鼠角膜TREM-1表達(dá)明顯升高，主要位于角膜上皮和角膜基質(zhì)；真菌感染組大鼠角膜炎癥反應(yīng)程度與角膜上皮中TREM-1表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.942，K0.001)。（2)煙曲霉菌孢子刺激液刺激體外培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞時(shí)，TREM-1表達(dá)升高較菌絲刺激液更加明顯，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(K0.05); Western blot結(jié)果

8、顯示，煙曲霉菌孢子刺激液加入細(xì)胞中4h，TREM-1蛋白表達(dá)升高，8h TREM-1蛋白表達(dá)達(dá)到高峰，各時(shí)間點(diǎn)與空白對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(代0.05)終濃度為10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的LP17均可抑制煙曲霉菌孢子刺激液誘導(dǎo)的角膜上皮細(xì)胞TREM-1 mRNA表達(dá)升高，抑制效果呈濃度依賴性，各濃度組之間TREM-1表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（代0.05);100ng/ml LP17能夠顯著抑制煙曲霉菌孢子刺激液

9、誘導(dǎo)的角膜上皮細(xì)胞TNF-a、IL-10、IL-6和IL-8分泌(K0.05)。(3) LP17能夠顯著抑制煙曲霉菌孢子刺激液誘導(dǎo)的角膜上皮細(xì)胞TREM-1、TLR-4和MyD88蛋白表達(dá)，CLI-095預(yù)處理也能夠部分阻斷煙曲霉菌孢子刺激液誘導(dǎo)的角膜上皮細(xì)胞TREM-1和TLR-4表達(dá)上調(diào)，此外ST2825同樣可以有效抑制TREM-1表達(dá)；LP17和CLI-095預(yù)處理均能不同程度的抑制TNF- a、IL-10、IL-6和IL-8分泌

10、，兩者對(duì)炎癥因子的抑制程度沒(méi)有明顯差別（P>0.05)，但兩種抑制劑聯(lián)合使用時(shí)各種炎癥因子的表達(dá)與單獨(dú)抑制組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(代0.05)。
　　結(jié)論：（1) TREM-1介導(dǎo)的炎癥放大作用與真菌性角膜炎的炎癥反應(yīng)進(jìn)程密切相關(guān);(2) TREM-1阻斷可以顯著抑制真菌感染后角膜上皮細(xì)胞炎癥因子的釋放，是抑制角膜炎癥反應(yīng)的潛在靶點(diǎn)；（3) TREM-1與TLR-4在介導(dǎo)真菌感染后角膜上皮炎癥反應(yīng)過(guò)程中具有協(xié)同促進(jìn)作用；（4)真