雷帕霉素脂質(zhì)體滴眼液對(duì)大鼠角膜新生血管抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：制備雷帕霉素(RAPA)脂質(zhì)體滴眼液，建立大鼠角膜堿燒傷動(dòng)物模型，研究RAPA對(duì)大鼠角膜新生血管(corneal neovasc[1larization，CNV)的抑制作用及它對(duì)HIF-lQ及VEGF表達(dá)的影響，探討RAPA抑制角膜新生血管的機(jī)理，并為通過(guò)抑制HIF-1Q阻斷VEGF信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制角膜新生血管提供理論依據(jù)。 方法：利用薄膜分散法制備RAPA脂質(zhì)體滴眼液，以正交設(shè)計(jì)法研究制備工藝中影響脂質(zhì)體制備質(zhì)量的主要影

2、響因素，篩選出較理想的處方。將42只健康Wistar大鼠隨機(jī)分為四組：A組正常對(duì)照組6只。B組堿燒傷空白對(duì)照組12只。C組堿燒傷空白脂質(zhì)體對(duì)照組12只。D組堿燒傷RAPA脂質(zhì)體治療組12只。制備大鼠角膜堿燒傷動(dòng)物模型，堿燒傷后： D組RAPA脂質(zhì)體滴眼液滴眼，每天三次。C組空白脂質(zhì)體滴眼液滴眼，每天三次。B組不予處理。另外各組氯霉素滴眼液預(yù)防感染，每天四次：每日裂隙燈觀察眼局部情況，并詳細(xì)記錄堿燒傷后大鼠角膜反應(yīng)情況及新生血管生長(zhǎng)情況，

3、并于堿燒傷后4d、7d、14d分別測(cè)量B、C、D三組角膜新生血管生長(zhǎng)長(zhǎng)度，計(jì)算生長(zhǎng)面積。分別于堿燒傷后1d、4d、7d、14d隨機(jī)抽取各組大鼠取材。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HIF-1Q及VEGF蛋白的表達(dá)，計(jì)算機(jī)圖象分析，測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的光密度值：半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(semi-qLlantitative reveFse。transcription p01ymerase chain reaction，RT-PCR)方法檢測(cè)角膜組織HIF_

4、lQmRNA及VEGF Mrna的表達(dá)，數(shù)字凝膠圖象分析系統(tǒng)測(cè)定各條帶光密度值(Q及VEGF分別與GAPDH的[DV比值作為HIF-Lq及VEGF表達(dá)水平的參數(shù)。 結(jié)果： 1．制得的RAPA脂質(zhì)體，為完整的類球形，平均粒徑為145.2nm，包封率為90.02％，RAPA脂質(zhì)體滴眼液中RAPA含量高，粒徑合適，可作為滴眼液用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 2．堿燒傷后ld時(shí)僅見(jiàn)損傷區(qū)角膜上皮水腫，角鞏膜緣周圍充血水腫；堿燒傷后4d可

5、見(jiàn)角鞏膜緣處有角膜新生血管芽呈毛刷狀向角膜中央生長(zhǎng)。第7d時(shí)，CNV顯著變長(zhǎng)，面積增加。14d時(shí)新生血管交織呈網(wǎng)狀，基本布滿整個(gè)角膜。 3．RAPA治療組與空白對(duì)照組及空白脂質(zhì)體對(duì)照組相比CNV生長(zhǎng)遲緩，稀疏，退化較早。CNV面積比較差異有顯著性(PO.05)。 4．正常大鼠角膜上皮細(xì)胞有微弱的HIF-1 Q蛋白、VEGF蛋白的表達(dá)：堿燒傷后角膜上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、

6、炎癥細(xì)胞，新形成的血管內(nèi)皮細(xì)胞，F(xiàn).1Q蛋白及VEGF蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng)，4d時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，7d時(shí)開(kāi)始下降，14d已降至正常。RAPA治療組HIF-1Q、VEGF的表達(dá)被顯著抑制，與空白對(duì)照組及空白脂質(zhì)體對(duì)照組相比差異有顯著性(P<0.01)。 5．正常大鼠角膜有少量VEGFmRNA的表達(dá)，堿燒傷后表達(dá)增強(qiáng)，4d時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，7d時(shí)開(kāi)始下降，14d已降至正常。HIF-1 Q Mrna在正常角膜基本不表達(dá)，堿燒傷后有所增強(qiáng)，1d及4d

7、時(shí)表達(dá)均高于正常，7d時(shí)已降至正常。RAPA治療組HIF-1 Q Mrna、VEGFmRNAF的表達(dá)被顯著抑制，與空白對(duì)照組及空白脂質(zhì)體對(duì)照組相比差異有顯著性(P