基于甘露糖受體的黑靈芝多糖免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究.pdf

1、多糖被證實(shí)具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤、降血糖、降血脂等多種功能，其中免疫調(diào)節(jié)作用是眾多多糖類物質(zhì)的最基本的作用，該調(diào)節(jié)方式主要通過(guò)以下幾個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)：直接或間接激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和T、B淋巴細(xì)胞；促進(jìn)細(xì)胞因子的生成與分泌；激活補(bǔ)體系統(tǒng)；促進(jìn)抗體產(chǎn)生等。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，多糖激活免疫細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用主要是通過(guò)與細(xì)胞表面的受體相結(jié)合而介導(dǎo)的。目前發(fā)現(xiàn)的受體主要包括Toll樣受體（TLRs）、甘露糖受體（MR）、樹突狀細(xì)胞相關(guān)C型凝集素-

2、1（Dectin-1）、補(bǔ)體受體3（CR3）、清道夫受體（SR）等。多糖與這些受體結(jié)合后可以激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，進(jìn)而活化免疫細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。MR可識(shí)別含甘露糖或巖藻糖殘基的多種糖分子，是先天免疫系統(tǒng)中重要的模式識(shí)別受體和內(nèi)吞受體，主要存在于巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，在維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)、識(shí)別病原體、誘導(dǎo)細(xì)胞因子、抗原遞呈等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。TLRs則是目前所發(fā)現(xiàn)的受體中與多糖關(guān)系最為密切的一類。
　　黑靈芝

3、既是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用真菌也是民間常見的食品配料，它具有多方面的生物活性。本實(shí)驗(yàn)室從黑靈芝中分離純化出一種水溶性多糖（PSG-1），綜合現(xiàn)代化學(xué)分析方法，解析出了其結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果表明 PSG-1的單糖組成為甘露糖、半乳糖和葡萄糖，摩爾比為1：1.28：4.91。實(shí)驗(yàn)室前期研究已確定 PSG-1具有增強(qiáng)宿主免疫功能的作用，在此基礎(chǔ)上開展 MR的研究對(duì)深入了解 PSG-1活性功能與免疫機(jī)制，以及基于 MR為靶向的黑靈芝的深度開發(fā)具有重要意義。因

4、此，本實(shí)驗(yàn)探討了PSG-1的免疫調(diào)節(jié)作用與MR的關(guān)系以及在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中PSG-1激活的TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與MR的關(guān)系。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　1、PSG-1對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MR的影響：為了探討PSG-1對(duì)正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MR的影響，本實(shí)驗(yàn)將20～160μg/mL PSG-1作用巨噬細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面MR的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞MR的mRNA表達(dá)水平；以MR抑制劑甘露聚糖預(yù)處理細(xì)胞30min后

5、加入PSG-1，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，酶聯(lián)免疫法測(cè)定培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β的含量，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示PSG-1可上調(diào)巨噬細(xì)胞表面MR的表達(dá)及MR mRNA水平；與單獨(dú)PSG-1處理組相比，甘露聚糖預(yù)處理可明顯抑制 PSG-1增強(qiáng)的巨噬細(xì)胞吞噬功能和誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IL-1β，對(duì)TNF-α的分泌則無(wú)影響。結(jié)論：MR能部分介導(dǎo)PSG-1對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的

6、免疫調(diào)節(jié)作用。
　　2、PSG-1對(duì)LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MR的影響：為了探討PSG-1對(duì)LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 MR的影響，本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè) PSG-1對(duì)LPS刺激的巨噬細(xì)胞表面MR的表達(dá)以及RT-PCR檢測(cè)PSG-1對(duì)LPS刺激的巨噬細(xì)胞MR mRNA的表達(dá)水平的影響，結(jié)果證明在LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥模型中，PSG-1對(duì)因LPS刺激下調(diào)的MR存在一定的上調(diào)作用。進(jìn)一步用抗MR抗體處理LPS和PSG

7、-1共同作用的巨噬細(xì)胞30min后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗MR抗體可以升高PSG-1抑制的LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力，且同時(shí)顯著升高了PSG-1抑制的LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IL-1β的分泌及IL-1β mRNA的表達(dá)效應(yīng)，但是卻明顯地降低了PSG-1促進(jìn)的LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IL-10的分泌及IL-10 mRNA的表達(dá)效應(yīng)，另外對(duì)PSG-1抑制的LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF-α的分泌及TNF-αmRNA表達(dá)效應(yīng)則未顯示出影響。結(jié)論：在LPS刺

8、激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中，PSG-1對(duì)細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用有賴于MR的參與。
　　3、PSG-1對(duì)LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 TLR2和TLR4的影響及其與MR在PSG-1介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用中的關(guān)系：本實(shí)驗(yàn)采用Western Blot檢測(cè)PSG-1對(duì)LPS刺激的巨噬細(xì)胞 TLR2和TLR4蛋白表達(dá)以及RT-PCR檢測(cè) TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)水平的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在LPS刺激的巨噬細(xì)胞中，PSG-1可通過(guò)作用于TLR4調(diào)節(jié)

9、巨噬細(xì)胞的功能。基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮前兩章結(jié)果中PSG-1對(duì)MR的影響，采用抗MR抗體封閉MR功能，進(jìn)一步研究抑制MR的功能后是否能對(duì)TLR4所介導(dǎo)的信號(hào)途徑產(chǎn)生影響。結(jié)果顯示，LPS刺激的巨噬細(xì)胞中，TLR4的MyD88依賴途徑被活化，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65的表達(dá)升高，細(xì)胞MAPKs的磷酸化水平也升高了；而加入高劑量PSG-1（160μg/mL）共同作用于細(xì)胞后，TLR4的表達(dá)被下調(diào)，核內(nèi)NF-κB p65的高表達(dá)有所降低，

10、MAPKs的磷酸化水平也同時(shí)受到了抑制，由此可知PSG-1的確作用于TLR4所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；當(dāng)細(xì)胞預(yù)先加入抗MR抗體作用后，與LPS和PSG-1共同作用的細(xì)胞相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅對(duì)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65由于PSG-1的作用而出現(xiàn)的表達(dá)降低有一定的回調(diào)作用，對(duì)其他分子的蛋白表達(dá)無(wú)明顯的影響。結(jié)論：PSG-1對(duì)LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白的表達(dá)可能受到TLR4和MR的共同調(diào)節(jié)。
　　綜上所述，P