蠶蛹蛋白的酶法水解及其產(chǎn)物的抗氧化性研究.pdf

1、蠶蛹(Silkwormpupa)是家蠶(BombyxmoriL.)生命周期中的一個發(fā)育階段。蠶蛹蛋白與蛹肽含有60％以上的人體必須氨基酸，還富含多種營養(yǎng)素，具有補充機體營養(yǎng)、促進生長發(fā)育、抗疲勞、抗衰老、提高人體免疫功能等多種功能。本文以蠶蛹蛋白為原料，主要研究了蠶蛹蛋白酶解產(chǎn)物在抗氧化方面的活性，優(yōu)化了酶解工藝，分離、純化、制備出活性物質(zhì)，并對活性物質(zhì)進行了分析和鑒定。 首先研究了蠶蛹脫脂蛋白的制備，從五種常用有機溶劑中選擇了

2、正己烷作為萃取劑，并優(yōu)化蠶蛹脫脂工藝，得到了高純度的蠶蛹脫脂蛋白。分別利用protamex復(fù)合蛋白酶、Flavourzyme復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、GC710中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、Alcalase堿性蛋白酶、復(fù)合胰蛋白酶等六種蛋白酶對脫脂蠶蛹蛋白進行水解，研究酶解產(chǎn)物的生物活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)六種蠶蛹蛋白酶解產(chǎn)物的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制活性水平均較低，但具有較強的清除1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH·)

3、、羥自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O2-)的能力，其中木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物清除自由基的能力最強。 研究了pH、溫度、加酶量、底物濃度等條件對蠶蛹蛋白水解度(DH)以及酶解液清除DPPH·、·OH和O2-的能力的影響。酶解液清除DPPH·、O2-和·OH的能力與其水解度的關(guān)系均表現(xiàn)為相似的趨勢。通過響應(yīng)面分析，分別獲得酶解液清除DPPH·、O2-和·OH活性的最佳酶解工藝條件(樣品濃度：30mg/mL)：(1)當(dāng)pH=7.36

4、、T=49.78℃、E/S=2.17％、t=1.90h，酶解液清除DPPH·的能力最強，清除率高達92.38％；(2)當(dāng)pH=7.48、T=50.23℃、E/S=2.00％、t=1.41h，酶解液清除O2-的能力最強，清除率為48.56％；(3)當(dāng)pH=7.58、T=49.95℃、E/S=2.10％、t=2.03h，酶解液清除·OH的能力最強，清除率i=93.97％。 采用SephadexG-25凝膠過濾色譜分離純化蠶蛹蛋白酶解

5、產(chǎn)物(SHOC)，得到了P1-P4四個組分，其清除DPPH·的能力為：P4＞P3＞P2＞P1，且P4清除DPPH·的能力為P3的3～4倍。分別收集P4的前半峰(P4F)和后半峰(P4L)并測定其清除DPPH·的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其自由基清除率分別比酶解液提高了5.28倍和6.49倍，且P4L清除DPPH·的能力與VC相當(dāng)，IC50(清除DDPH·50％所需加入清除劑的濃度)達到0.1524mg/mL。利用RP-HPLC對P3、P4F、P4L

6、進行了分析，發(fā)現(xiàn)P3組成較為復(fù)雜，難以進一步分離純化；進一步利用LC-MS對P4F，P4L進行組成分析和結(jié)構(gòu)鑒定。發(fā)現(xiàn)P4F中的兩個主要組分P4F2，P4F3的分子量分別為168和222，其中P4F3為二肽Phe-Gly；P4L中的主要組分P4L1與P4F2的質(zhì)譜圖完全一樣，分子量均為168，因此為同種物質(zhì)。進一步利用反相高壓液相色譜C18制備柱制備活性物質(zhì)P4F2、P4F3，并通過冷凍干燥得到了這兩種物質(zhì)。測定P4F2、P4F3清除D