幽門(mén)螺桿菌感染個(gè)體化治療檢測(cè)基因芯片試劑盒的研制.pdf

1、[目的]細(xì)菌感染引起的疾病日益威脅著人類的健康,造成的死亡威脅也不容小視,同時(shí),細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題正日益受各國(guó)政府的普遍重視,抗生素類藥物的不當(dāng)使用已經(jīng)對(duì)社會(huì)、經(jīng)濟(jì)以及公共衛(wèi)生造成了一定影響。有效治療和控制這類疾病的關(guān)鍵在于,能夠在治療前快速、靈敏、特異地給出細(xì)菌及其耐藥情況的檢測(cè)結(jié)果。本研究的目的是建立一種能同時(shí)檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌克拉霉素(23S)、喹諾酮(gyrA)耐藥位點(diǎn)和人PPI代謝相關(guān)CYP2C19的基因多態(tài)性情況的可視化基因芯片檢

2、測(cè)方法,為臨床用藥提供快速、有效的實(shí)驗(yàn)室依據(jù),在臨床診斷前給出相應(yīng)的用藥指導(dǎo),針對(duì)性地選擇藥物進(jìn)行個(gè)體化用藥,保證治療成功率,同時(shí)減少抗生素濫用帶來(lái)的不良反應(yīng)和資源浪費(fèi)。
　　[方法]選擇CYP2C19*2、CYP2C19*3、23S-2142、23S-2143、gyrA-87、gyrA-91為檢測(cè)靶基因。優(yōu)化人胃粘膜中,人與幽門(mén)螺桿菌基因組的提取方法,設(shè)計(jì)特異性引物;通過(guò)對(duì)引物比例、體系成分、雜交條件等的調(diào)節(jié)來(lái)優(yōu)化四重PCR反應(yīng)

3、體系;篩選特異性探針;優(yōu)化酪胺信號(hào)放大體系及反應(yīng)條件等以期提高基因芯片檢測(cè)信號(hào)的特異性和靈敏度。構(gòu)建人CYP2C19*2、CYP2C19*3野生型和突變型質(zhì)粒作為人基因組質(zhì)控參考品和標(biāo)準(zhǔn)品;使用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株26695作為細(xì)菌基因組質(zhì)控參考品,在100份菌株中篩選出包含各個(gè)野生、突變位點(diǎn)的4株作為細(xì)菌基因組標(biāo)準(zhǔn)品。通過(guò)對(duì)大量野生和突變菌株的雜交及測(cè)序結(jié)果篩選比對(duì),確定芯片的判讀標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)篩查196份經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)的臨床胃粘膜樣本,對(duì)比細(xì)菌

4、培養(yǎng)結(jié)果和50份隨機(jī)抽取樣本的測(cè)序結(jié)果,對(duì)檢測(cè)芯片的基本性能指標(biāo),如特異性,靈敏度,重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　[結(jié)果]由選擇的靶基因篩選出了4對(duì)特異性引物和15條SNP探針。確定了菌株及胃粘膜最合適的基因組DNA提取方法為一步直接煮沸法。成功構(gòu)建了人基因組相應(yīng)野生和突變型質(zhì)粒,篩選出了細(xì)菌各耐藥位點(diǎn)的野生型和突變型菌株,同時(shí)確定了芯片的判讀標(biāo)準(zhǔn)。最佳四重PCR體系為:CYP2C19*2與CYP2C19*3,兩對(duì)引物的標(biāo)記引物與非標(biāo)記引

5、物的比例均為1:10,CYP2C19*2與CYP2C19*3的非熒光引物的終濃度均為0.12μmol/L,23S與gyrA,兩對(duì)引物的標(biāo)記引物與非標(biāo)記引物的比例均為1:1,23S與gyrA的非熒光引物的終濃度分別為0.1μmol/L、0.2μmol/L,鎂離子濃度為2.0mmol/L;Taq酶濃度為2.0U;dNTPs濃度為196μmol/L。優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃,15min;變性95℃,20s;退火延伸65℃,60s;

6、延伸72℃,5min。最佳雜交液組分為:2×SSC、1.2％SDS、5%甲酰胺。構(gòu)建了人基因組CYP450-2C192、2C193野生和突變型質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品,同時(shí)用四重PCR體系分析100份培養(yǎng)菌株,篩選了幽門(mén)螺桿菌野生型和突變型標(biāo)準(zhǔn)品。芯片可以檢測(cè)出不低于103CFU/ml的幽門(mén)螺桿菌和不低于2ng/μl的人基因組DNA。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,準(zhǔn)確率均達(dá)100%。在此基礎(chǔ)上通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)每組探針進(jìn)行判讀標(biāo)準(zhǔn)的確定,然后對(duì)196份

7、臨床胃粘膜樣本基因組DNA檢測(cè),隨機(jī)測(cè)序驗(yàn)證準(zhǔn)確率均在80%以上,批間批內(nèi)變異系數(shù)CV值均小于15%。
　　[結(jié)論]本研究建立了一種高通量、高靈敏度、高特異性的可同時(shí)分析幽門(mén)螺桿菌克拉霉素、喹諾酮耐藥位點(diǎn)和PPI代謝相關(guān)人CYP2C19的基因多態(tài)性的可視化基因芯片檢測(cè)方法。能夠在幽門(mén)螺桿菌三聯(lián)療法前,不經(jīng)培養(yǎng)通過(guò)一次實(shí)驗(yàn)給出H.pylori對(duì)克拉霉素和喹諾酮的耐藥信息及PPI代謝情況,結(jié)果可靠、操作簡(jiǎn)單易行、成本低,為臨床醫(yī)生針對(duì)