纖維素酶的定向進(jìn)化、定點(diǎn)誘變及耐堿機(jī)理研究.pdf

1、近年來(lái)，纖維素酶在制漿造紙、紡織和洗滌劑工業(yè)上得到了廣泛的應(yīng)用。作為工業(yè)酶制劑；這些應(yīng)用一般要求在中性或堿性條件下進(jìn)行，因此堿性或耐堿性纖維素酶的研究逐漸受到重視。本課題組已經(jīng)從堿性土樣中篩選獲得一株耐堿性纖維素酶生產(chǎn)菌株一枯草芽孢桿菌Y106，并將其纖維素酶基因克隆到pUC18質(zhì)粒上構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC18-7，在大腸桿菌JM109中獲得表達(dá)。表達(dá)的纖維素酶Cel 18-7與原始菌株產(chǎn)生的酶一樣在pH6.0～6.5時(shí)CMC酶活力最高，這

2、顯然不能滿(mǎn)足造紙、紡織、洗滌劑等行業(yè)的生產(chǎn)要求。為了適應(yīng)工業(yè)應(yīng)用的要求，本研究采用體外定向進(jìn)化和定點(diǎn)誘變的方法對(duì)纖維素酶進(jìn)行分子改造，以期獲得堿性條件下酶活提高的耐堿性突變株。 本文采用易錯(cuò)PCR技術(shù)和致突變菌株技術(shù)，建立了纖維素酶突變體文庫(kù)。使用雙層平板檢測(cè)法和液體酶活驗(yàn)證法對(duì)突變體庫(kù)進(jìn)行篩選，一共篩選了600個(gè)突變體，沒(méi)有篩到堿性酶活提高的突變體，只獲得一株耐酸性突變體(Cel 18-7-12)，最適pH為6.0。測(cè)序結(jié)果顯

3、示，纖維素酶第339位的氨基酸由Ile變?yōu)門(mén)hr，并且發(fā)生終止突變?cè)斐蒀-末端25個(gè)氨基酸的缺失。為了研究纖維素酶C-末端CBD對(duì)酶活性質(zhì)的影響，設(shè)計(jì)引物采用PCR方法切除纖維素酶C末端163個(gè)氨基酸并命名為CBDcut。對(duì)酶活性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，CBDcut酶活力有少量提高，pH性質(zhì)基本沒(méi)有變化，由此可以推測(cè)纖維素酶的CBD切除之后對(duì)酶的酸堿性質(zhì)沒(méi)有影響。 通過(guò)比對(duì)Cel 18-7所屬的第五家族幾個(gè)具有代表性纖維素酶的氨基酸序列

4、，發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于Cel 18-7 212位和140位的氨基酸殘基具有高度的保守性，所有堿性纖維素酶在212位都是His，酸性酶都是Asn；在140位堿性纖維素酶都是Ile，酸性酶都是Gln，而Cel 18-7相應(yīng)位置的氨基酸分別是Asn和His。這種在特定位置高度保守的氨基酸殘基很可能對(duì)酶的結(jié)構(gòu)與功能起重要作用，尤其與該酶的耐堿性有關(guān)。 為了研究纖維素酶的耐堿性機(jī)理，采用重組PCR技術(shù)對(duì)Cel 18-7第212和140位的氨基酸殘基

5、進(jìn)行定點(diǎn)突變。第212位由Asn突變?yōu)镠is和Asp，第140位由His突變?yōu)镚ln，帶有突變的基因片段克隆到質(zhì)粒pUC18上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pUC18-7-N212H、pUC18-7-N212D和pUC18-7-H140Q。然后分別對(duì)重組質(zhì)粒在大腸桿菌JM109中表達(dá)的未突變和突變的纖維素酶性質(zhì)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cel 18-N212H最適pH由6.0-6.5偏移到6.5-7.0，堿性條件下酶活提高；Cel 18-N212D最適pH偏

6、移到5.5，堿性條件下酶活降低；Cel 18-H140Q最適pH偏移到5.0，但對(duì)酸堿的耐受度提高了。 通過(guò)同源模建，用Swiss-model服務(wù)器構(gòu)建了重組纖維素酶和各種突變的纖維素酶的三維結(jié)構(gòu)立體圖。通過(guò)對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)的分析，檢測(cè)突變位點(diǎn)氨基酸殘基對(duì)整個(gè)酶分子造成的影響，進(jìn)一步比較突變位點(diǎn)氨基酸殘基的側(cè)鏈原子與催化殘基的羧基氧原子之間的距離變化以及兩催化殘基之間的距離變化，從活性中心氨基酸殘基的帶電性能、空間位阻、與催化殘基形