膽固醇代謝相關(guān)酶Srebf2,Hmgcr,CYP51,Clusterin在ALS轉(zhuǎn)基因小鼠模型脊髓中的mRNA水平變化.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)是運(yùn)動神經(jīng)元病(MND)最常見的類型。脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元，腦干后組運(yùn)動神經(jīng)核及錐體束均有選擇性受累。ALS病理表現(xiàn)為脊髓和延髓上下運(yùn)動神經(jīng)元損害并存，疾病后期病人呼吸機(jī)無力致呼吸衰竭并發(fā)肺部感染而死亡。為了進(jìn)一步深入探索ALS的發(fā)病機(jī)制，我們對經(jīng)典的ALS動物模型（SOD1G93A轉(zhuǎn)基因動物）進(jìn)行了Microarray全基因表達(dá)譜分析，以及散發(fā)ALS病人的血清進(jìn)行了質(zhì)譜篩查，發(fā)現(xiàn)膽固醇代謝通路多個環(huán)節(jié)的酶存

2、在異常改變。大腦占整個機(jī)體體重的2％，但大腦膽固醇占整個機(jī)體膽固醇總量的25％。膽固醇是構(gòu)成細(xì)胞的重要成份之一，它分布于人體各組織中，其中在腦組織中含量最豐富。膽固醇在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，膜運(yùn)輸，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，突觸形成以及神經(jīng)元發(fā)揮正常功能都有重要作用。不同與其他系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)膽固醇多來源于自身合成，神經(jīng)系統(tǒng)膽固醇主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞合成，膽固醇在膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元間可以運(yùn)輸，維持穩(wěn)定狀態(tài)，由于血腦屏障的存在，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周器官的膽

3、固醇代謝相對隔離。一旦神經(jīng)系統(tǒng)膽固醇代謝受到影響，神經(jīng)元功能就會受到影響，最終導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常及顯著的神經(jīng)變性。神經(jīng)系統(tǒng)膽固醇代謝異常見于多種神經(jīng)變性疾病。亨廷頓病病人及動物模型中發(fā)現(xiàn)有血漿膽固醇水平降低，神經(jīng)系統(tǒng)膽固醇合成減少，神經(jīng)元細(xì)胞膜膽固醇增多。在阿爾茲海默病細(xì)胞及動物模型中，膽固醇水平升高可以增加腦內(nèi)淀粉樣蛋白，而他汀類藥物可以降低淀粉樣蛋白。多項研究表明ALS（肌萎縮側(cè)索硬化）病人存在能量代謝異常，高脂血癥為預(yù)后保護(hù)因素

4、。SOD1G93A小鼠也有類似報道。本實(shí)驗室SOD1G93A小鼠基因表達(dá)譜資料顯示，膽固醇代謝通路異常。Srebf2，CYP51，LSS，HMG-Coas，HMG-Coar，DCRH7，lp1，ApoE，Clusterin等膽固醇代謝相關(guān)蛋白在ALS小鼠發(fā)病期較對照小鼠均有較顯著的改變。
　　 本實(shí)驗應(yīng)用國際公認(rèn)的ALS轉(zhuǎn)基因模型（SOD1G93A小鼠）來研究SOD1-G93A小鼠60天及癥狀早期腰髓srebf2，hmgcr，C

5、YP51以及clusterin的表達(dá)差異，進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗驗證表達(dá)譜結(jié)果，探索ALS疾病中脊髓膽固醇代謝的變化。
　　 方法:(1)轉(zhuǎn)基因鼠的繁殖所有動物均飼養(yǎng)在恒溫、恒濕和無菌條件的(Specificpathogenfree，SPF)環(huán)境中，喂以滅菌的SPF級顆粒型鼠類飼料。為維持B6SJL.TgN(SOD1G93A)1Gur轉(zhuǎn)基因小鼠突變基因穩(wěn)定下傳，將B6SJLSOD1G93A/+半合子雄鼠與B6SJLF1/J半合子雌

6、鼠交配繁殖。子代鼠經(jīng)基因鑒定確定是否帶有人突變SOD1G93A的基因。(2)實(shí)驗分組研究對象共分為兩組組:60天，癥狀早期(120天左右)。每個時期組選擇雌性SOD1G93A小鼠及同窩野生型小鼠各3只。(3)基因芯片結(jié)果分析和篩選通過分析本實(shí)驗室的轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓基因芯片數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)有20個膽固醇代謝相關(guān)酶有變化，其中下調(diào)的包括:Srebf2，Hmgcr，Hmgcs1，mvk,Pmvk,mvd,FDFT1,SQLE,LSS,DHCR24,C

7、YP51,DHCR7,SC4MOL，NSDH1，SC5D，ldlr;上調(diào)的有:Ch25h，ApoE，Clusterin，Lrp1，選取srebf2，hmgcr，CYP51以及clusterin。進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗驗證表達(dá)譜結(jié)果。(4)Srebf2，Hmgcr,CYP51，Clusterin基因表達(dá)水平的測定用滅活RNase器械取材，取小鼠腰膨大，放入-80℃保存。采用PrimerPremier5.0設(shè)計上下游引物（跨內(nèi)含子），采用Ol

8、igo7.0分析引物，確定最終引物。采用Trizol法提取總RNA，測RNA濃度。Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行上述四個基因的RT-PCR。
　　 結(jié)果:基因表達(dá)譜結(jié)果表明在癥狀早期小鼠脊髓中，Srebf2，Hmgcr,CYP51均降低，而Clusterin在發(fā)病小鼠脊髓中水平升高。在隨后的RT-PCR實(shí)驗中，與同窩對照相比，SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠在60天，癥狀早期脊髓中Srebf2，Hmgcr,CYP51基因表

9、達(dá)均無明顯變化;而在癥狀早期clusterin在轉(zhuǎn)基因小鼠中有明顯升高。和我們的ALS病人血清蛋白組學(xué)資料一致的是，ALS病人血清內(nèi)Clusterin水平升高。
　　 結(jié)論:本實(shí)驗在肌萎縮側(cè)索硬化SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)疾病癥狀早期脊髓clusterinmRNA水平有基因表達(dá)上調(diào)，但其他與膽固醇代謝相關(guān)的酶mRNA水平?jīng)]有明顯變化。提示ALS發(fā)病中Clusterin可能在非膽固醇代謝通路上發(fā)揮作用，但并不能排除膽固