蝎毒促增殖肽(BmKpp)對(duì)小鼠的輻射保護(hù)作用研究.pdf

1、背景和目的：
　　目前，超過(guò)50％的腫瘤病人在病程中需接受放射治療，電離輻射（Ionizing radiation,IR）會(huì)導(dǎo)致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)等成分損傷。骨髓造血抑制是放療的常見副作用，這個(gè)副作用主要表現(xiàn)為造血干/祖細(xì)胞的增殖能力下降，部分病人可以表現(xiàn)為持續(xù)的髓系造血抑制或骨髓功能衰竭，這提示HSCs自我更新能力的缺陷及HSCs數(shù)量的下降。

2、IR也會(huì)導(dǎo)致胃腸道損傷，主要是腸道絨毛的損傷及腸粘膜屏障功能的破壞，IR導(dǎo)致胃腸道出血、內(nèi)毒素產(chǎn)生、細(xì)菌感染、腹瀉及水電解質(zhì)紊亂。雖然電離輻射損傷（Ironizing radiation injury，IRI）在臨床上已經(jīng)得到充分證實(shí)，其機(jī)制的研究結(jié)果也在不斷積累，但對(duì)IRI的有效預(yù)防及治療還是不足，因此亟待研發(fā)出新的可以在臨床和輻射事故等應(yīng)用的對(duì)抗輻射損傷的藥物。本課題在前期工作的基礎(chǔ)上深入研究和探討蝎毒促增殖肽（Buthus mar

3、tensii Karsch proliferation peptide，BmKpp）對(duì)全身輻射（Total body irradiation，TBI）后小鼠造血及腸道功能恢復(fù)的影響及機(jī)制，為開發(fā)治療輻射損傷的新藥提供理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料與方法：
　　1. BmKpp組分LD50測(cè)定：取昆明小鼠進(jìn)行急性藥物毒性試驗(yàn)，按0.0245 mg/kg-0.5000mg/kg濃度腹腔給藥，據(jù)各組動(dòng)物死亡情況，結(jié)果按Bliss法

4、程序統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)數(shù)BmKpp的LD50。
　　2. BmKpp最佳濃度篩選：C57BL/6小鼠，TBI(6Gy,X線輻射)（200cGy/min)，輻射前后按2.10~5.25μg/kg濃度腹腔給藥，28d后分析動(dòng)物生存情況。
　　3. BmKpp與SVPII對(duì)輻射后小鼠生存的影響：C57BL/6小鼠，經(jīng)TBI（7.5GyX線輻射，200cGy/min）后，分為3組：A.輻射對(duì)照組（IR+，下同）：注射生理鹽水；B. IR+

5、+SVPII：SVPII100μg/kg；C. IR++BmKpp：BmKpp2.63μg/kg。觀察兩藥對(duì)TBI后小鼠體重、生存率及毛發(fā)等的影響。
　　4. BmKpp對(duì)輻射后小鼠骨髓造血恢復(fù)的支持作用：①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同前。分為3組：A.正常對(duì)照組（IR-，下同）；B. IR+：經(jīng)TBI（4Gy X線輻射,200cGy/min，下同）后，注射生理鹽水；C. IR++BmKpp：輻射后注射BmKpp2.625μg/kg。于TBI后第5

6、、7、14及28d對(duì)小鼠骨髓有核細(xì)胞(Bone marrow nucleated cells，BMNCs)、血常規(guī)進(jìn)行分析；②體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分4組：A. IR+； B：IR++IL-3；C:IR++SVPII；D:IR++BmKpp，對(duì)小鼠BMNCs進(jìn)行集落形成單位數(shù)（Colony forming-unit，CFU）分析及長(zhǎng)期骨髓細(xì)胞培養(yǎng)。
　　5. BmKpp對(duì)輻射后小鼠腸道損傷的保護(hù)作用：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及處理同前。經(jīng)(4Gy X

7、線輻射,200cGy/min)后5h，脫臼處死小鼠，取出靠近幽門部小腸組織，分別用TUNEL法檢測(cè)輻射后小鼠小腸絨毛固有層細(xì)胞的凋亡情況；TBI5d后脫臼處死小鼠，取出靠近幽門部小腸組織，制作病理切片，HE染色觀察小鼠腸道隱窩細(xì)胞面積、隱窩細(xì)胞數(shù)量及隱窩細(xì)胞密度變化。
　　6. BmKpp輻射保護(hù)作用的機(jī)制探討：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同前及處理方法同前，照射劑量為4.0Gy（X線輻射，200cGy/min)。在動(dòng)物輻射前及輻射后7d、14d或2

8、8d分離小鼠BMNCs，Annexin-V/Sca-1雙染法觀察細(xì)胞凋亡，熒光探針DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，磷酸化H2AX檢測(cè)評(píng)估DNA斷裂情況，Real-time PCR定量分析P16、P21 mRNA表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)P16、P21蛋白表達(dá)，β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)了解輻射后體外長(zhǎng)期培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞衰老情況。
　　結(jié)果：
　　1．BmKpp的LD50和有效濃度的確定：BmKpp的LD50為0.105mg/kg

9、；小鼠體內(nèi)腹腔注射濃度為2.625μg/kg(1/40 LD50)時(shí)無(wú)明顯毒性，且能對(duì)TBI后的C57BL/6小鼠發(fā)揮最佳的輻射保護(hù)作用，故確定2.625μg/kg為BmKpp為有效濃度并用于后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
　　2．BmKpp對(duì)輻射后小鼠生存情況的影響：經(jīng)BmKpp處理后，經(jīng)致死劑量（7.5Gy） TBI后小鼠的長(zhǎng)期生存率從IR+組的0提高至40%，并顯著延長(zhǎng)了小鼠的平均生存時(shí)間，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。SVPII也能延長(zhǎng)小

10、鼠的生存時(shí)間，但是沒有BmKpp顯著。在TBI后長(zhǎng)達(dá)1年的觀察中發(fā)現(xiàn)，BmKpp處理小鼠的毛發(fā)變白情況較IR+組及SVPII處理組明顯減輕（p<0.05）。
　　3.BmKpp對(duì)輻射后小鼠造血恢復(fù)的促進(jìn)作用：BmKpp能顯著提高TBI后小鼠BMNCs數(shù)，各時(shí)間點(diǎn)與IR+組相比，均明顯優(yōu)于IR+組（p<0.05），且BmKpp組骨髓BMNCs在照射后第14d即恢復(fù)至輻射前水平（p>0.05）；BmKpp能促進(jìn)TBI后白細(xì)胞總數(shù)、中性

11、粒細(xì)胞數(shù)及血小板數(shù)的增加，其中白細(xì)胞數(shù)在 TBI后28d恢復(fù)正常，中性粒細(xì)胞數(shù)及血小板數(shù)TBI后14d恢復(fù)正常，明顯優(yōu)于IR+組（p<0.05）。集落形成單位計(jì)數(shù)分析顯示，SVPII與BmKpp組的細(xì)胞集落較IR+組及IL-3組密集，體積更大，且在第7及14d CFU數(shù)均明顯優(yōu)于IR+組及IR++IL-3組（p=0.001）,另外，SVPII及BmKpp可以令輻射后小鼠骨髓細(xì)胞長(zhǎng)期體外培養(yǎng)至8w,且其集落細(xì)胞數(shù)較IR+組及IR++IL-

12、3組多(p<0.05)，提示BmKpp具有促進(jìn)TBI后小鼠造血細(xì)胞增殖，促進(jìn)造血恢復(fù)的作用。
　　4.BmKpp對(duì)輻射后小鼠腸道損傷的保護(hù)及促進(jìn)修復(fù)作用：Bmkpp能增加TBI后小腸隱窩面積，促進(jìn) TBI后小腸隱窩細(xì)胞再生及增殖，并減少 TBI后小腸絨毛固有層內(nèi)細(xì)胞凋亡，與IR+組相比，p<0.05。提示BmKpp具有減低TBI后小鼠放射性腸炎程度，促進(jìn)小腸粘膜損傷修復(fù)的作用。
　　5. BmKpp輻射保護(hù)作用機(jī)制的探討：B

13、mKpp能降低TBI后小鼠BMNCs ROS水平，并抑制 TBI誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用，降低輻射后小鼠骨髓長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞的衰老細(xì)胞比例，與TBI后IR+組相比具顯著性差異（p<0.05）；Bmkpp的作用下，TBI后小鼠的γH2AX的熒光強(qiáng)度在第7d及14d均低于IR+組（p<0.05），提示Bmkpp具有減少輻射后DNA損傷或促進(jìn)DNA修復(fù)的作用；實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析p16及 p21 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果提示BmKpp對(duì)TBI后小鼠BM

14、NCs的p16及p21 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響與IR+組相比，呈先升后降的變化（p<0.05）；在28d時(shí)對(duì)BMNCs的P16及P21蛋白分析結(jié)果也表明，BmKpp能降低輻射后小鼠衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)，這對(duì)于TBI后促進(jìn)DNA修復(fù)及減少衰老的發(fā)生具有重要意義。
　　結(jié)論：
　　1．BmKpp的LD50為0.105mg/kg，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體內(nèi)腹腔注射濃度為2.625μg/kg(1/40 LD50)時(shí)無(wú)明顯毒性，且能對(duì)TBI后的C5

15、7BL小鼠發(fā)揮最佳的輻射保護(hù)作用。
　　2．BmKpp可促進(jìn)輻射后小鼠骨髓造血干/祖細(xì)胞的增殖，縮短TBI后小鼠BMNCs以及外周血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及血小板的恢復(fù)時(shí)間縮短，BmKpp也可促進(jìn)輻射后小鼠腸道組織的修復(fù)，并最終通過(guò)促進(jìn)造血及胃腸道功能的恢復(fù)達(dá)到延長(zhǎng)輻射后小鼠壽命，提高生存率。
　　3.BmKpp能有效降低小鼠BMNCs內(nèi)ROS水平，減輕DNA損傷，促進(jìn)DNA損傷后修復(fù)，并且降低BMNCs的凋亡率，減少衰老細(xì)胞比