蝎毒促增殖肽Bmkpp在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的分子靶標(biāo)研究.pdf

1、背景和目的：
　　蝎毒是由粘多糖類(lèi)，透明質(zhì)酸酶，磷脂酶，相對(duì)小分子量的5-羥色胺，組胺，蛋白酶抑制劑以及多肽類(lèi)等組成的具有多種生理、藥理作用的生物活性物質(zhì)[1]。近期研究顯示，從東亞鉗蝎中分離出的蝎毒多肽SVP不但可以高選擇性殺傷多種腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)帶瘤小鼠的免疫力，還可以減輕放化療對(duì)骨髓造血功能抑制的副作用[2]。本課題組從東亞鉗蝎蝎毒中分離出來(lái)一種新的多肽蝎毒增殖肽[3]（Buthus martensi Karsch proli

2、ferating peptide，Bmkpp），由66個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為7212.32830 Da。課題組前期試驗(yàn)結(jié)果顯示Bmkpp有促進(jìn)γ射線(xiàn)或X射線(xiàn)照射后的小鼠骨髓造血細(xì)胞集落形成，以及M-NSF-60細(xì)胞的增殖，促進(jìn)輻射后骨髓造血恢復(fù)等作用。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于骨髓內(nèi)的非造血干細(xì)胞，具有多項(xiàng)分化潛能，在一定條件下可自我更新并分化成多種細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能生成絕大多數(shù)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，為造血干細(xì)胞提供微環(huán)境

3、[4-8]。因此，尋找Bmkpp在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上的靶點(diǎn)，可為其促造血增殖的機(jī)制研究提供理論依據(jù)。
　　本研究以SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs為細(xì)胞模型，利用親和層析法+質(zhì)譜法提取及分析Bmkpp的相關(guān)靶蛋白，用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)其結(jié)合部位及觀(guān)察其對(duì)胞內(nèi)鈉、鈣離子濃度的調(diào)控作用。結(jié)果可為確立Bmkpp在BMSCs上的分子靶標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為闡明其在促造血增殖、輻射保護(hù)及抗衰老等方面的藥理作用奠定理論基礎(chǔ)。
　　材料和

4、方法：
　　SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由中山大學(xué)干細(xì)胞研究中心提供，東亞鉗蝎蝎毒由河南醫(yī)科大學(xué)生物毒素中心提供。
　　一、Bmkpp制備
　　1、采用Sephadex G-50凝膠層析和CM-Sepharose Fast Flow弱陽(yáng)離子交換層析從東亞鉗蝎蝎毒中分離純化出蝎毒促增殖肽Bmkpp。
　　2、采用RP-HPLC檢測(cè)Bmkpp純度。
　　二、Bmkpp測(cè)序及比對(duì)
　　1、Edeman降解法測(cè)定

5、Bmkpp氨基酸全序列；
　　2、將Bmkpp全序列輸入BLAST蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。
　　三、親和層析法+質(zhì)譜法分析Bmkpp相關(guān)靶蛋白
　　1、試劑盒提取大鼠BMSCs全蛋白、膜蛋白、胞漿蛋白后上樣到Bmkpp親和層析柱，洗脫收集相關(guān)蛋白峰，超濾離心法脫鹽濃縮；
　　2、上樣緩沖液處理后，采用15％SDS-PAGE電泳分析洗脫蛋白；
　　3、質(zhì)譜鑒定洗脫蛋白。
　　四、多克隆抗體的制備及細(xì)胞免疫

6、熒光檢測(cè)結(jié)合部位
　　1、以福氏佐劑乳化后的Bmkpp注射新西蘭家兔，ELISA監(jiān)測(cè)血清抗體效價(jià)。
　　2、細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)結(jié)合部位。
　　五、Bmkpp對(duì)胞內(nèi)離子的調(diào)控
　　分別用流式細(xì)胞儀Bmkpp對(duì)長(zhǎng)期加藥培養(yǎng)的MSC細(xì)胞內(nèi)Na+、Ca2+濃度變化。
　　結(jié)果：
　　1、分離、純化出Bmkpp和其相鄰的峰4，RP-HPLC檢測(cè)Bmkpp純度達(dá)95%。
　　2、經(jīng)Edeman降解法鑒定，B

7、mkpp氨基酸全序列為VRDGYIADDK NCAYFCGRNA YCDDECKKNG AESGYCQQAG VYYNACWCYY LLDDVVIIIP SGCDQW，比對(duì)結(jié)果顯示Bmkpp序列與α-Toxins家族的一些氨基酸序列重合度達(dá)百分之八十以上，具有α-Toxins固定位置的八個(gè)半胱氨酸。Bmkpp屬于α-Toxins，可作用于電壓門(mén)控鈉離子通道。
　　3、一步親和層析洗脫峰均為兩個(gè)，電泳結(jié)果顯示胞漿洗脫蛋白條帶較多，但

8、細(xì)胞膜無(wú)結(jié)合蛋白條帶。改變鹽濃度分步梯度洗脫全蛋白共得4個(gè)峰，1 mol/ L NaCl鹽濃度分步洗脫全蛋白于13kDa處，14kDa,40 kDa處，260 kDa處有4條較明顯的電泳條帶。經(jīng)質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，13 kDa，14 kDa處的蛋白為組蛋白，40 kDa的蛋白為肌動(dòng)蛋白，260 kD靶蛋白為細(xì)胞骨架蛋白。
　　4、經(jīng)過(guò)八次免疫后，兔血清抗體效價(jià)達(dá)1:409600，細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示Bmkpp結(jié)合在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的