老年血虧陰虛失眠證候大鼠模型的建立及酸棗仁湯干預(yù)作用研究.pdf

1、目的：本課題結(jié)合臨床建立老年血虧陰虛型失眠證候動物模型，并將該復(fù)合型模型與傳統(tǒng)單因素睡眠剝奪模型進行對照，遵循中醫(yī)因-脈-證-治的思路進行評價：首先對“因”進行分析，即根據(jù)中醫(yī)病因病機來評價造模因素的科學(xué)性；然后對“脈”進行觀測，即觀測模型較直接、直觀、重要的中醫(yī)體表特征，并確認這種模型的證候?qū)傩?；接著對“證”進行探討，即通過分子生物學(xué)等現(xiàn)代科技手段對體表特征所反映的老年血虧陰虛型失眠病理機制進行概括；最后用驗方酸棗仁湯“治”來進行反證

2、，探討對應(yīng)治法驗方酸棗仁湯的作用及其可能機制，并建立基于代謝網(wǎng)絡(luò)變化的中藥復(fù)方系統(tǒng)生物學(xué)藥效評價平臺。 方法：在對酸棗仁湯的促眠作用進行實驗研究之后，將健康Wistar大鼠100只(雌雄各半、體重200g±20g)隨機分成5組，每組20只：環(huán)境對照組；睡眠剝奪組《單因素模型組)；證候模型組(復(fù)合因素模型組)；酸棗仁湯大劑量組；酸棗仁湯小劑量組．其中環(huán)境對照組給予其它組睡眠剝奪時相似的水環(huán)境；單因素模型組采用自制多平臺水環(huán)境法剝奪

3、睡眠48h劍備；復(fù)合因素模型組及酸棗仁湯大、小劑量組均采用頸背部皮下注射D-半乳糖6w、然后腹腔同時注射環(huán)磷酰胺和氫化可的松5d、接著用自制多平臺水環(huán)境法剝奪睡眠48h制備復(fù)合模型，造模歷時共7w；酸棗仁湯大、小劑量組在造模4w后開始同時灌胃給藥3w，其它組均給予等容積生理鹽水。指標檢測具體方法如下： 1、通過同步檢測體重、攝食量、腋溫、及顯微放大拍照爪、尾、口唇等部位，對各組實驗大鼠的中醫(yī)體表特征進行比較； 2、用組織

4、化學(xué)法檢測各組實驗大鼠大腦皮質(zhì)、海馬部位自由基和一氧化氮合酶(NOS)水平的變化； 3、采用血液細胞分析儀檢測各組實驗大鼠血細胞計數(shù)的變化； 4、采用Morris水迷宮實驗檢測各組實驗大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變； 5、透射電鏡下觀察各組實驗大鼠大腦皮質(zhì)部位超微結(jié)構(gòu)的病理改變； 6、采用高相液相法檢測各組實驗大鼠大腦皮質(zhì)及下丘腦部位谷氨酸(Glu)及γ-氨基丁酸(GABA)含量的變化； 7、采用免疫組化

5、染色和mRNA半定量RT-PCR法檢測分析各組實驗大鼠大腦皮質(zhì)及海馬部位γ-氨基丁酸A受體(GABAAR)a1和γ2亞單位的表達改變； 8、采用免疫組化染色法檢測各組實驗大鼠大腦皮質(zhì)部位星形膠質(zhì)細胞的表達改變。 結(jié)果： 1、與空白對照組比較，舒樂安定組、酸棗仁湯大、小劑量組均能顯著延長閾上劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠時間(P<0.01)，顯著增加閾下劑量戊巴比妥鈉致小鼠入睡率(P<0.01)。且酸棗仁湯大劑量組作用比

6、小劑量組更明顯，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)； 2、中醫(yī)體表特征顯示，與環(huán)境對照組比較，睡眠剝奪組出現(xiàn)失眠癥狀，表現(xiàn)為重度疲勞狀態(tài)；與睡眠剝奪組比較，證候模型組在出現(xiàn)失眠癥狀的同時，出現(xiàn)面色無華，閉目，血呈暗紅，嗜睡，食欲明顯下降，四肢無力，毛蓬豎少光澤等血虧陰虛體表特征，且體重、攝食量顯著下降(P<0.01)，而腋溫的下降無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與證候模型組比較，酸棗仁湯大、小劑量組對血虧陰虛體表特征有改善作用，但無統(tǒng)

7、計學(xué)意義(P>0.05)； 3、與證候模型組比較，其它各組大鼠大腦皮質(zhì)、海馬丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和NOS活性均明顯降低(P<0.01，P<0.05)。且酸棗仁湯大、小劑量組呈現(xiàn)一定量效關(guān)系(P<0.05)； 4、與證候模型組比較，其它各組大鼠全血中紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)及血紅蛋白含量顯著升高(P<0.01)。且酸棗仁湯大、小劑量組呈現(xiàn)一定量效關(guān)系(P<0.05)； 5、在定位

8、航行實驗中，與證候模型組比較，環(huán)境對照組和酸棗仁湯大、小劑量組大鼠實驗4d及2d的潛伏期均顯著縮短(P<0.01)。在空間搜索實驗中，各組平臺象限的游泳距離占總距離百分比、池壁20％和40％區(qū)域游泳距離百分比的實驗結(jié)果表現(xiàn)出與定位航行實驗各組一致的趨勢；與證候模型組比較，環(huán)境對照組和酸棗仁湯大、小劑量組跨過原平臺位置次數(shù)明顯升高(P<0.01)。兩種模型組間相比無明顯差異(P>0.05)； 6、睡眠剝奪48h后，透射電鏡下顯示：

9、睡眠剝奪組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞異染質(zhì)輕微聚集，趨邊排列，核周間隙輕微增寬，大部分線粒體中高度水腫，線粒體基質(zhì)及線粒體脊消失；證候模型組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞間胞質(zhì)水腫，連接增寬，可見單個神經(jīng)元細胞異染質(zhì)凝聚，趨邊，呈現(xiàn)凋亡形態(tài)，細胞器消失：酸棗仁湯大、小劑量組能改善大鼠神經(jīng)元細胞超微結(jié)構(gòu)的病理改變； 7、與環(huán)境對照組比較，睡眠剝奪組大鼠大腦皮質(zhì)及下丘腦部位氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu、GABA含量均明顯增高(P<0.01)，但GAB

10、A增加更為明顯，Glu/GABA比例減小；與環(huán)境對照組比較，證候模型組大鼠Glu、GABA含量均明顯增高(P<0.01)，但Glu增加更為明顯，Glu/GABA比例增大；與證候模型組比較，酸棗仁湯大、小劑量組大鼠大腦皮質(zhì)及下丘腦部位氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu、GABA含量顯著減少，但Glu減少更為明顯，Glu/GABA比例減小，并呈現(xiàn)一定量效關(guān)系(P<0.05)； 8、與證候模型組比較，環(huán)境對照組和酸棗仁湯大、小劑量組大鼠大腦皮質(zhì)及

11、海馬部位的GABAARa1和γ2亞單位免疫化學(xué)累積光密度明顯較低(P<0.01)，皮質(zhì)部位GABAARa1和γ2 mRNA的表達均顯著下調(diào)(P<0.01)．而與睡眠剝奪組比較，證候模型組表達相對較弱(P<0.05)； 9、與證候模型組比較，環(huán)境對照組和酸棗仁湯大、小劑量組大鼠睡眠剝奪48h后星形膠質(zhì)細胞標志物—膠原纖維酸性蛋白(GFAP)在皮質(zhì)部位表達明顯較弱；與睡眠剝奪組比較，證候模型組表達亦相對較強。 結(jié)論：

12、 1、酸棗仁湯具有明顯的鎮(zhèn)靜催眠作用，且大劑量作用強于小劑量； 2、模型大鼠的體表特征顯示，D-半乳糖+環(huán)磷酰胺、氫化可的松+睡眠剝奪這一復(fù)合模型較接近臨床老年血虧陰虛型失眠患者的表現(xiàn)，是一種可行、可靠的復(fù)合型動物模型； 3、老年大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和大腦皮質(zhì)病理損傷與睡眠剝奪、血虧陰虛證候具有相關(guān)性。自由基水平增加、全血象減少是老年血虧陰虛型失眠的病理機制之一。反證驗方酸棗仁湯可有效改善證候模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及修復(fù)腦

13、損傷，其作用機理可能與抗自由基、補血作用有關(guān)； 4、大腦皮質(zhì)及下丘腦部位Glu，GABA含量及Glu/GABA比值均升高可能是老年血虧陰虛型失眠的神經(jīng)生物學(xué)病理機制。酸棗仁湯治療老年血虧陰虛型失眠的作用機制可能與通過下調(diào)大腦皮質(zhì)及下丘腦部位Glu、GABA的含量及Glu/GABA的比值來保護腦組織有關(guān)。 5、睡眠剝奪可明顯上調(diào)大鼠腦內(nèi)皮質(zhì)及海馬部位GABAARa1和γ2亞單位表達。酸棗仁湯治療老年血虧陰虛型失眠的作用機制