酸棗仁皂苷A對大鼠心肌缺血再灌注的保護作用及機制研究.pdf

1、一、研究背景
　　 冠心病為內(nèi)科常見病及多發(fā)病,是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一,全國每年約有110萬人死于冠心病。溶栓治療、經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(percutaneouscoronary intervention,PCI)或冠狀動脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypassgraft,CABG)是縮小急性心肌梗死梗塞范圍和改善臨床預(yù)后的最有效方法。但部分患者或動物心肌缺血后再灌注,使缺血所致的功能和代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞進

2、一步加重,這種現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardialischemia/reperfusion injury,MIRI),臨床表現(xiàn)為在閉塞的冠狀動脈再通、梗死區(qū)血液灌流重建后一段時間內(nèi),有的病例發(fā)生血壓驟降、心功能不全、心律失常甚至猝死等病情惡化的現(xiàn)象。因此,MIRI的發(fā)生機制與防治越來越引起人們的關(guān)注,并一直試圖尋找能對MIRI產(chǎn)生確切保護作用的藥物。
　　 心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機制十分復(fù)雜,而細胞調(diào)亡是心肌缺血再

3、灌注損傷發(fā)生的重要機制之一。與細胞壞死過程不同,細胞凋亡又稱程序性細胞死亡是指有核細胞在一定條件下通過啟動其內(nèi)部機制,主要通過內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細胞自然死亡過程。細胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷中的發(fā)生可能與以下因素有關(guān):①活性氧大量生成:再灌注導(dǎo)致大量氧自由基釋放,造成生物膜脂質(zhì)過氧化、各種酶蛋白失活及DNA損傷；②細胞內(nèi)鈣超載:心肌缺血再灌注過程中,線粒體內(nèi)Ca2+大量聚集,引起線粒體內(nèi)膜上的通透性轉(zhuǎn)換孔開放,釋放細胞色素

4、C入胞質(zhì)內(nèi),進一步激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶誘致細胞凋亡。③線粒體損傷:在細胞凋亡期間,盡管線粒體能維持其超微結(jié)構(gòu)的正常,但事實上其功能已經(jīng)發(fā)生顯著改變,如線粒體內(nèi)膜通透性增大,線粒體內(nèi)膜的跨膜電位下降,能量合成水平顯著降低。上述因素并不能直接引起細胞凋亡,而是通過一定的信號傳遞方式激活生存或死亡相關(guān)基因,然后將信號傳遞到核內(nèi)切酶,而執(zhí)行死亡的功能。因此阻斷心肌缺血再灌注損傷中心肌細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠阻止凋亡程序的執(zhí)行,減少心肌細胞凋

5、亡,防治心肌缺血再灌注損傷。
　　 酸棗仁是鼠李科植物酸棗(Ziziphus psinosa Hu)的干燥成熟種子,具有斂汗,養(yǎng)肝,寧心安神等多種功效。酸棗仁主要含有多種酸棗仁皂苷類等化合物。酸棗仁皂苷是酸棗仁的水溶性成分,酸棗仁皂苷A是其中的主要有效成份之一。研究發(fā)現(xiàn),酸棗仁提取物具有調(diào)脂、降壓、抗動脈粥樣硬化、抗心律失常、抗心肌缺血、抗心肌細胞缺氧一復(fù)氧損傷作用。酸棗仁皂甙A具有抑制血管平滑肌細胞過度增殖而抗動脈粥樣硬化,同

6、時對腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的細胞凋亡有明顯的抑制作用,但是目前對于其對心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制尚未報道。
　　 二、研究方法
　　 目的:
　　 在整體水平,我們采用建立大鼠在體心肌缺血再灌注模型模擬急性心肌梗死后再灌注損傷的病理生理變化,酸棗仁皂苷A于造模前腹腔注射給藥干預(yù),旨在觀察其抗細胞凋亡、保護心肌等作用,并進一步探明其作用機制(主要是其對凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和Cyt

7、C的影響)；在細胞水平,采用過氧化氫損傷原代大鼠心肌細胞建立氧化損傷模型,酸棗仁皂苷A預(yù)處理后觀察其對心肌細胞形態(tài)及細胞凋亡的影響,探明其抑制細胞凋亡的作用機制(主要是與PKCε信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系),為臨床上有效防治心肌缺血再灌注損傷提供新思路。本課題分三個部分進行:第一部分酸棗仁皂苷A預(yù)處理對大鼠缺血再灌注是否有保護作用,重點觀察其抗氧化作用及其對心肌組織結(jié)構(gòu)、心肌損傷標志物、再灌注心律失常及心功能的影響；第二部分酸棗仁皂苷A預(yù)處理對

8、缺血再灌注心肌細胞凋亡的影響,從蛋白質(zhì)水平觀察酸棗仁皂苷A的抗凋亡作用,并探求其作用機制；第三部分觀察酸棗仁皂苷A對過氧化氫誘導(dǎo)新生大鼠心肌細胞凋亡及PKCε表達的影響,進一步明確其作用機制。
　　 研究方法:
　　 第一部分:采用結(jié)扎(15 min)和松開(30 min)左冠狀動脈前降支(LAD)的方法制備心肌缺血再灌注損傷模型。44只雄性wistar大鼠隨機分為4組,分別為假手術(shù)組(n=8)、模型組(n=12)、酸棗

9、仁皂甙A組(n=12)及表沒食子兒茶素沒食子酸酯組(n=12)。酸棗仁皂苷A組及EGCG組的給藥劑量均為20mg·kg-1·d-1,假手術(shù)組和模型組給予等體積的生理鹽水,均為腹腔注射,連續(xù)用藥3d,末次給藥30min后進行造模。Ⅱ?qū)?lián)心電圖觀察再灌注30min期間心律失常的發(fā)生情況,根據(jù)Roringerova T方法進行室性心律失常(ventricular arrhythmias,VA)評分,Medlab6.0生物信號采集處理系統(tǒng)監(jiān)測左

10、心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、收縮期左心室內(nèi)壓上升的最大變化速率(+dp/dtmax)、舒張期左心室內(nèi)壓下降的最大變化速率(-dp/dtmax)分別在缺血前、缺血15min、再灌注15、30min時的變化。標本收集:實驗結(jié)束時腹主動脈采血,同時在心底部將心臟與大血管及組織離斷,取出心臟,去除左右心房及右心室,心肌置入冰生理鹽水中沖洗3次,將左心室分離為三部分,一部分用精密電子天平稱取記錄質(zhì)量,剪碎勻漿,作為SOD

11、、MDA檢測用,一部分放入4％多聚甲醛中固定,作為組織切片備用,以觀察心肌組織病理結(jié)構(gòu),另一部分放入-80℃冰箱中保存?zhèn)洌谎菏覝仂o放30min,在4℃離心后,取其上清置-80℃冰箱保存,檢驗肌酸磷酸激酶(CK)及乳酸脫氫酶(LDH)水平。
　　 第二部分:40只雄性wistar大鼠隨機分為4組,每組10只,分別為假手術(shù)組、模型組、酸棗仁皂甙A組及表沒食子兒茶素沒食子酸酯組,其余同第一部分。以末端脫氧核昔酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)介導(dǎo)

12、的脫氧三磷酸尿昔(dUTP)缺口末端標記法(TdT—mediated du Tpniekend labeling,TUNEL)檢測凋亡心肌細胞,計算細胞凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI)；取出-80℃冰箱中保存的部分心肌,提取蛋白及定量后,采用蛋白印跡法檢測Bax、CytC及Bcl-2表達,采用分光光度法檢測caspase-3的活性。
　　 第三部分:采用差速貼壁法分離培養(yǎng)Wistar新生乳鼠心肌細胞,以過氧化氫作

13、用心肌細胞建立氧化損傷模型,將培養(yǎng)72 h的原代心肌細胞,選擇搏動良好、生長密度無明顯差異的細胞按孔隨機分為以下4組:①對照組:細胞培養(yǎng)過程中不給予任何處理;②模型組:心肌細胞培養(yǎng)基中加終濃度為500μmol/L過氧化氫作用4h；③酸棗仁皂苷A治療組:操作同模型組,但在給予H2O2前加入酸棗仁皂苷A至終濃度為20mg/l干預(yù)24小時;④PKC抑制劑組(JA+Chelerythrine):操作同治療組,但在給予H2O2前5min加入Che

14、lerythrine至終濃度5umol/L。倒置顯微鏡觀察心肌細胞形態(tài)學和搏動頻率的變化；四唑鹽(MTT)比色法檢測心肌細胞活力；流式細胞儀檢測細胞凋亡率；采用分光光度法檢測caspase-3的活性；蛋白印跡檢測CtyC及PKCε表達。統(tǒng)計分析:實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料數(shù)據(jù)以x±s表示。對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗。多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析處理,方差齊性時兩兩比較采用LSD法；方差不齊時,多組數(shù)據(jù)間比較采

15、用Welch法,兩兩比較采用Games—Howell法。各實驗組缺血前及缺血再灌注不同時間點心功能指標采用重復(fù)測量方差分析。檢驗顯著性水準α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:
　　 1、大鼠心肌組織病理形態(tài)學HE染色光鏡下觀察顯示,假手術(shù)組大鼠心肌細胞形態(tài)規(guī)則、排列整齊,肌纖維完整,未見心肌細胞水腫、變性、壞死,未見中性粒細胞浸潤。模型組心肌細胞排列紊亂,局部肌纖維橫紋消失,腫脹明顯,較多的中性粒細胞浸

16、潤。酸棗仁皂苷A治療組可見心肌細胞水腫及中性粒細胞浸潤,但都較模型組輕,心肌受損程度有所下降；EGCG組心肌組織病理形態(tài)學變化與酸棗仁皂苷A治療組相似。
　　 2、缺血再灌注對大鼠LDH、CK、SOD及MDA的影響再灌注結(jié)束后檢測各組LDH、CK、SOD及MDA值。結(jié)果顯示,I/R組、JA組、EGCG組的LDH及CK值均較Sham組明顯增高(P<0.01)；各組SOD值均顯著降低,與Sham組比較有顯著性差異(P<0.01)；各

17、組MDA值均顯著增高,與Sham組相比有顯著性差異(P<0.01)。表明缺血再灌注可造成心肌嚴重損傷,證實心肌缺血再灌注模型構(gòu)建成功。
　　 3、酸棗仁皂甙A對缺血再灌注大鼠LDH、CK、SOD及MDA的影響經(jīng)統(tǒng)計學檢驗,各組間LDH、CK、SOD及MDA的水平均有顯著差異(LDH:F=69.104,P=0.000；CK:F=143.320,P=0.000；SOD:F=101.844,P=0.000；MDA:F=212.780,

18、P=0.000)。JA和EGCG均可明顯抑制再灌注所導(dǎo)致的LDH、CK、MDA的升高,同時顯著增加SOD的活性,與I/R組相比有顯著性差異(P<0.01)；上述指標在JA組與EGCG組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05),表明JA和EGCG均具有抗氧化作用而減輕心肌缺血再灌注損傷。
　　 4、再灌注心律失常44只大鼠中12只被排除,剩余32只中26只發(fā)生心律失常,心律失常多出現(xiàn)于再灌注早期,包括室性早博、室性心動過速和心室纖顫等；假手

19、術(shù)組僅有偶發(fā)室性早搏,未見其他類型心律失常。模型組均出現(xiàn)嚴重的心律失常,以頻繁室速、室顫為主,伴有少量的房室傳導(dǎo)阻滯,其中2只大鼠因為室顫而死亡。經(jīng)統(tǒng)計學檢驗,各組間心律失常評分差異顯著(F=44.699,P=0.000)。與假手術(shù)組比較,模型組心律失常評分顯著上升,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。酸棗仁皂苷A治療組也出現(xiàn)了心律失常,以室早及室速為主,與模型組比較心律失常評分顯著下降(P=0.005)。EGCG組的心律失常以室早及

20、陣發(fā)室速為主,與酸棗仁皂苷A組比較,心律失常評分無顯著性差異(P=0.080)。5、心功能指標各組缺血前的INSP、LVEDP和±dp/dtmax差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。缺血再灌注時各組間大鼠左室收縮末壓(LVSP)由高到低依次為Sham組、EGCG組、酸棗仁皂苷A組及I/R組；等容收縮期左心室最大上升速率(+dp/dtmax)及等容舒張期左心室下降最大速率(-dp/dtmax)由高到低依次為Sham組、酸棗仁皂苷A組、EGC

21、G組及I/R組；左室舒張末壓(LVEDP)由低到高依次為Sham組、EGCG組、酸棗仁皂苷A組及I/R組。經(jīng)統(tǒng)計學分析,缺血再灌注時個組間LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、LVEDP差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。不同缺血再灌注時間點檢測結(jié)果表明,LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax隨著時間延長而降低,LVEDP隨著時間延長而升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。各時間點與組別間有交互作用(P<0.01

22、)。以上結(jié)果表明缺血再灌注可導(dǎo)致心臟收縮及舒張功能受損,酸棗仁皂苷A可改善大鼠收縮及舒張功能。
　　 第二部分:
　　 1、各組心肌組織TUNEL結(jié)果按試劑盒提供的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法原位檢測凋亡細胞。正常心肌細胞核呈藍色；凋亡心肌細胞核呈深淺不一的棕褐色。經(jīng)統(tǒng)計學檢驗,各組間AI差異顯著(F=198.001,P=0.000)。I/R組AI為(18.14±2.22)％,JA和EGCG預(yù)處理后AI顯著下降(

23、P<0.01)；與Sham組比較,JA組和EGCG組中AI顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 2、Western bloting檢測各組大鼠心肌Bcl-2、Bax及細胞色素C的表達通過分析目的條帶的光密度值(IOD)發(fā)現(xiàn),各組間Bcl—2、Bax、Bcl-2/Bax及細胞色素C的表達均有顯著差異(Bcl-2:F=22.463,P=0.000;Bax:F=82.507,P=0.000；Bcl-2/Bax:F=31

24、.350,P=0.000；細胞色素C:F=96.916,P=0.000)。在Sham組中心肌組織有一定量的Bcl-2及Bax表達,胞漿中細胞色素C的含量極少,I/R組心肌Bcl-2蛋白表達顯著減少(P=0.000),而Bax及胞漿中細胞色素C蛋白表達顯著增加,Bcl—2/Bax比值顯著降低(P<0.01)；JA組和EGCG組中Bax及胞漿中細胞色素C表達較I/R組顯著下降(P<0.01),但Bcl—2的表達較I/R組顯著升高(P<0.0

25、1),Bcl—2/Bax比值顯著高于I/R組(P<0.01)。JA組與EGCG組中的Bcl—2、Bax、胞漿中CytC表達及Bcl—2/Bax比值無顯著性差異(P>0.05)；此兩組中Bax表達與Sham組比較無顯著性差異(P>0.05),Bcl-2、胞漿中CytC表達及Bcl—2/Bax比值與Sham組比較有顯著性差異(P<0.01)。
　　 3、各組caspase-3活性檢測結(jié)果caspase-3活性測定顯示,各組間casp

26、ase-3活性差異顯著(F=39.663,P=0.000)。正常心肌細胞的caspase-3活性水平很低,在體缺血15分鐘,再灌注30分鐘后心肌caspase-3的活性顯著升高(P=0.000)；經(jīng)過JA及EGCG預(yù)處理后心肌caspase-3的活性顯著減少(P<0.01),但JA組與EGCG組的caspase-3活性間無顯著性差異(P=0.817)。
　　 第三部分:
　　 1、各組心肌細胞形態(tài)學觀察倒置顯微鏡下觀察,

27、正常心肌細胞從72h起細胞成單層成簇生長,心肌細胞核折光性好,偽足飽滿并相互連接,生長呈半融合狀態(tài),搏動明顯,節(jié)律一致,60～80次/min；模型組細胞核暗淡,偽足顯著變細,細胞間連接明顯減少,搏動節(jié)律減慢,20～30次/min；與模型組比較,酸棗仁皂苷A治療組心肌細胞形態(tài)明顯改善,細胞核折光性較好,偽足略變細,搏動有力,節(jié)律一致,50～60次/min；與酸棗仁皂苷A治療組比較,PKC抑制劑組心肌細胞細胞核折光性較差,偽足變細,細胞間連

28、接減少,搏動節(jié)律減慢,30～40次/min。
　　 2、各組心肌細胞活力與細胞凋亡的結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學檢驗,各組間心肌細胞活力、細胞凋亡差異顯著(心肌細胞活力:P=87.752,P=0.000；細胞凋亡:F=657.061,P=0.000)。與對照組比較,模型組心肌細胞活力顯著降低(P=0.000),細胞凋亡率則顯著增加(P=0.000)；與模型組比較,JA組心肌細胞活力顯著增加(P=0.000),細胞凋亡率則顯著降低(P=0.000

29、)；與JA組比較,PKC抑制劑組心肌細胞活力顯著降低(P=0.008),細胞凋亡率則顯著增加(P=0.000)。
　　 3、Western blot檢測各組心肌細胞CtyC及PKCε的表達情況經(jīng)統(tǒng)計學瞼驗,各組間CtyC及PKCε的表達差異顯著(CtyC:F=210.511,P=0.000:PKCε:F=42.589,P=0.000)。與對照組比較,模型組胞漿中細胞色素C顯著增多(P=0.000),PKCε表達無顯著性差異(P=

30、O.235)；JA預(yù)處理后,細胞色素C表達顯著減少(P=0.000),PKCε表達顯著升高(P=0.000)；與JA組比較,PKC抑制劑組胞漿中細胞色素C顯表達顯著增多(P=0.000),PKCε表達顯著降低(P=0.000)。
　　 4、各組caspase-3活性檢測經(jīng)統(tǒng)計學檢驗,各組間caspase-3活性差異顯著(F=663.629,P=0.000)。與對照組比較,模型組Caspase-3的活性顯著增加(P=0.000)；

31、與模型組比較,JA組的Caspase-3活性顯著降低(P=0.000)；Chelerythrin干預(yù)后,Caspase-3活性顯著升高(P=O.000)。
　　 結(jié)論:
　　 1、本實驗通過在體大鼠心肌缺血/再灌注模型,證實了心肌缺血/再灌注可導(dǎo)致心肌損傷,酸棗仁皂苷A預(yù)處理可以減輕心肌的損傷,降低LDH、CK、MDA值,升高SOD值,減少再灌注心律失常,改善心功能。
　　 2.心肌缺血/再灌注和過氧化氫損傷可以

32、引起心肌細胞凋亡,酸棗仁皂苷A預(yù)處理可以減少心肌細胞凋亡。因此酸棗仁皂苷A可減輕心肌缺血再灌注損傷,與其抑制心肌細胞凋亡有關(guān)。
　　 3.酸棗仁皂苷A預(yù)處理可以上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax蛋白表達,升高Bcl-2/Bax比值,抑制細胞色素C從線粒體中的釋放,減少caspase-3在心肌組織中活性從而減少心肌細胞凋亡。
　　 4.PKC是預(yù)適應(yīng)機制的重要環(huán)節(jié),酸棗仁皂苷A預(yù)處理可增強心肌細胞膜PKCε的蛋白表達,經(jīng)Chele