葡萄霜霉病毒全基因組測序及候選效應(yīng)蛋白R7的功能研究.pdf

1、葡萄霜霉病(Grape Downy Mildew)是全球范圍內(nèi)危害葡萄生產(chǎn)的重大病害，病害流行年份可造成20％～80％的損失，嚴(yán)重時(shí)幾乎顆粒無收。成功和高效防控葡萄霜霉病是葡萄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要條件。探索葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)與葡萄的互作關(guān)系，可以為葡萄霜霉病的防控提供更為有效的途徑或方法。本研究完成了葡萄霜霉病菌的全基因組測序，對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，預(yù)測了含有RXLR保守結(jié)構(gòu)域的候選效應(yīng)蛋白

2、，并對候選蛋白R7（本實(shí)驗(yàn)室命名）進(jìn)行了功能鑒定，為揭示葡萄霜霉病菌的致病機(jī)制，研發(fā)新的防控技術(shù)提供了分子基礎(chǔ)和依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.葡萄霜霉病菌的全基因組測序及數(shù)據(jù)分析
　　采用454和illumina方法對葡萄霜霉病菌進(jìn)行全基因組測序，共建立了4個(gè)庫，最終獲得10.37 G數(shù)據(jù)。根據(jù)現(xiàn)組裝結(jié)果確定基因組大小約為240 M，遠(yuǎn)大于原先估計(jì)的120 M，與致病疫霉大小相似，大于其它已測序的卵菌。對基因組進(jìn)行nt庫

3、同源注釋，發(fā)現(xiàn)同源性較高的多為細(xì)菌，在卵菌中，與致病疫霉(Hytophthora infestans)同源性最高，而與庫中葡萄霜霉病菌同源序列為1.28％，這也說明nt庫中所含的葡萄霜霉病菌基因序列信息非常少。
　　2.葡萄霜霉病菌RXLR候選效應(yīng)蛋白的預(yù)測
　　對基因組序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，最終預(yù)測出RXLR/QXLR候選效應(yīng)子序列1822個(gè)，其中含有RXLR/QXLR-dEER結(jié)構(gòu)域的共97個(gè)。預(yù)測的RXLR效應(yīng)子數(shù)量

4、多于大部分已測序的卵菌。
　　3.7個(gè)RXLR候選效應(yīng)蛋白的功能鑒定
　　將7個(gè)RXLR候選效應(yīng)子編號為R1～R7，并進(jìn)行信號肽鑒定和煙草瞬時(shí)表達(dá)分析。結(jié)果顯示，R1和R2預(yù)測的信號肽不具備泌出功能;R3在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上均有分布，其余幾個(gè)候選子均定位于細(xì)胞核;R5和R7可誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)，R3、R4、R6不能抑制Bax引起的過敏性壞死反應(yīng)。說明R5和R7參與霜霉菌與植物之間的互作。
　　4.葡萄霜霉病菌效應(yīng)

5、蛋白R7的功能研究
　　對候選效應(yīng)子R7進(jìn)行了詳細(xì)的功能鑒定。對RFLR-DEER及其周圍氨基酸進(jìn)行點(diǎn)突變，結(jié)果顯示，R7蛋白仍能從胞外轉(zhuǎn)運(yùn)至植物細(xì)胞內(nèi);預(yù)測了R7的核定位信號序列，驗(yàn)證了其核定位功能，并發(fā)現(xiàn)R7誘導(dǎo)煙草過敏性壞死反應(yīng)依賴于核定位;分段刪除試驗(yàn)結(jié)果顯示，R7第101～125位和509～583位的氨基酸序列很可能是誘導(dǎo)煙草細(xì)胞過敏性壞死反應(yīng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。
　　5.葡萄霜霉病菌效應(yīng)蛋白R7誘導(dǎo)的細(xì)胞過敏性壞死反應(yīng)