CpG-ODN對兩種病原菌聯(lián)合誘導(dǎo)的山羊?qū)嶒炐匀橄傺椎谋Ｗo研究.pdf

1、本文以泌乳初期的睢寧白山羊為研究對象，探討了CpG-ODN對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌聯(lián)合誘導(dǎo)的山羊?qū)嶒炐匀橄傺椎淖饔?，并對乳腺組織的二維凝膠電泳進行了初步的探索，為今后的深入研究提供了實驗依據(jù)。本試驗主要包括以下三部分： 1.CpG-ODN對兩種菌聯(lián)合誘導(dǎo)的實驗性乳腺炎山羊乳腺的保護研究 選擇同處于泌乳初期的睢寧白山羊6頭，體重為30-40 kg。產(chǎn)后第5天，于右乳區(qū)經(jīng)過乳導(dǎo)管灌注CpG-ODN(劑量10μg·kg-1體

2、重)，左乳區(qū)灌注等體積的滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01mol/L pH7.2)作為對照，灌注后第3天按同等劑量進行二次灌注，產(chǎn)后第9天，于左右乳區(qū)經(jīng)乳導(dǎo)管灌注2×109 CFUml/L金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，Saureus)和2×109 CFUml/L大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)各1.5 mL。灌注后72 h，處死動物，取乳腺組織。臨床癥狀及病理切片觀察均顯示，乳腺內(nèi)

3、灌注2×109 CFUml/L的金黃色葡萄球菌和2×109 CFUml/L大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)能成功誘導(dǎo)山羊典型的乳腺炎癥狀。與灌注PBS相比，乳腺灌注CpG-ODN能顯著降低乳腺組織中部分炎癥相關(guān)因子及酶的含量，腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)的含量顯著降低(P<0.05)，白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-6(

4、Interleukin-1，IL-6)含量有所降低但差異不顯著(P>0.05)；N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAGase)活性極顯著降低(P<0.01)，髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)活性顯著降低(P<0.05)。實驗結(jié)果表明灌注CpG-ODN可以抑制乳腺組織內(nèi)IL-1β、TNF-α等炎性細胞因子及和炎癥相關(guān)酶的釋放、減輕炎癥因子對乳腺的損傷，證實了

5、CpG-ODN對金葡菌和大腸桿菌聯(lián)合感染誘發(fā)的山羊乳腺炎的乳腺有保護作用。 2.CpG-ODN對兩種菌聯(lián)合誘導(dǎo)的實驗性乳腺炎山羊乳和血清中相關(guān)細胞因子與酶的影響 對定時采集的乳樣和血清中相關(guān)細胞因子和酶的活性迸行分析。結(jié)果顯示，PBS和CpG-ODN處理乳區(qū)乳中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平同在感染后24 h上升至最高，但感染后24 h CpG-ODN乳區(qū)較PBS側(cè)下降10.38％(P<0.05)。CpG-ODN能顯

6、著提高感染前乳汁白細胞介素-2(IL-2)水平。灌注CpG-ODN乳區(qū)IL-1β在感染后24 h上升至最高(P<0.01)，而灌注PBS乳區(qū)則在感染后48 h上升至最高(P<0.01)，在感染后24 h、48 h較PBS乳區(qū)分別下降了11.87％(P<0.05)、28.72％(P<0.01)。灌注CpG-ODN側(cè)乳中NAGase、MPO活性隨時間的變化表現(xiàn)為先上升后下降，在24h達到最大值；PBS側(cè)乳中NAGase、MPO活性隨時間變化

7、表現(xiàn)出相同的規(guī)律，但NAGase峰值高于灌注CpG-ODN側(cè)，MPO峰值低于灌注CpG-ODN側(cè)；血清中TNF-α先上升后下降，第24 h時最大，第8h與第0h相比差異顯著(P<0.05)；IL-1β、IL-2均先下降后上升再下降，分別在第24 h、48 h時達最大，各時間點與第0h相比差異均不顯著；MPO活性隨時間的變化先下降后上升，24 h最低，與0h相比差異極顯著(P<0.01)；NAGase活性變化與MPO一致，到達最小值的時間

8、為第48 h，各時間點與第0h相比差異均不顯著。結(jié)果表明CpG-ODN可通過提高乳中IL-2水平、加速并促進乳汁TNF-α、IL-1β的釋放，對縮短炎癥過程也有一定的作用，證實CpG-ODN對金葡菌和大腸桿菌聯(lián)合感染誘發(fā)的山羊乳腺炎有一定的保護作用。 3.CpG-ODN對實驗性乳腺炎山羊乳中乳鐵蛋白含量及乳腺組織二維凝膠電泳譜的影響 用ELISA法對實驗中定時采集的乳樣進行乳鐵蛋白含量測定。結(jié)果顯示，灌注CpG-ODN乳

9、區(qū)乳鐵蛋白含量隨時間的變化先上升后下降，在第16 h達到最大(P<0.01，compared to0 th hour)，灌注PBS的乳區(qū)乳鐵蛋白含量隨時間的變化也是先上升后下降，在第24 h達到最大(P<0.01，compared to0 th hour)。CpG-ODN可能通過影響非特異性免疫在乳腺炎發(fā)生時發(fā)揮對機體的保護作用，此外，本實驗以乳腺組織為對象，初步建立乳腺蛋白質(zhì)組研究的二維電泳(two-dimensional elect