CD40信號復合體新組分的鑒定與功能初探.pdf

1、CD40分子是腫瘤壞死因子受體超家族的成員,不僅僅表達于正常的淋巴細胞中,而且在大多數(shù)的造血惡性腫瘤和上皮惡性腫瘤中也存在廣泛的表達。因為CD40分子在免疫反應中的中心地位,它在自身免疫性疾病的發(fā)病機制中也扮演著非常中的作用。近年來許多證據(jù)甚至表明CD40信號轉(zhuǎn)導通路在癌癥的發(fā)生發(fā)展中也有著重要作用。由于CD40信號轉(zhuǎn)導通路在自身免疫性疾病和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病機制中發(fā)揮著非常重要的作用,已經(jīng)有一些針對CD40信號轉(zhuǎn)導通路的藥物已經(jīng)處

2、于開發(fā)、研制狀態(tài)。因此通過各種研究技術和手段深入研究CD40信號轉(zhuǎn)導通路的分子機制,以期尋找疾病診斷的分子標記物以及治療的藥物靶標已成為目前研究的熱點。為了深入研究CD40信號轉(zhuǎn)導通路涉及的大分子蛋白及其功能,本研究主要應用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法,鑒定出CD40信號復合體中的新組分,并對新組分的功能進行了初步探討。
　　本研究應用基于內(nèi)源免疫沉淀實驗結(jié)合質(zhì)譜鑒定的方法對A20細胞(小鼠B細胞淋巴瘤細胞系)中CD40配體誘導形

3、成的CD40信號復合體作為樣品進行分析。首先,將A20細胞用anti-CD40刺激10min或者不處理,然后每組分別用CD40抗體或IgG抗體進行免疫沉淀,接著應用SDS-PAGE對免疫沉淀復合物進行分離,電泳后的凝膠用考馬斯亮藍染料進行染色處理,確定差異蛋白質(zhì)的條帶。對一些差異蛋白條帶進行膠內(nèi)酶切,并通過高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測序,最后通過Mascot檢索軟件的MS/MS離子方式檢索數(shù)據(jù)庫檢索鑒定蛋白質(zhì)。通過檢索PUBMED文獻或其它

4、的數(shù)據(jù)庫,對鑒定的差異蛋白質(zhì)的生物學功能進行了解和分類,為進一步深入研究這些差異蛋白的功能以及其在信號轉(zhuǎn)導通路中的作用打下了一定的基礎。同時對感興趣的差異的蛋白質(zhì)利用內(nèi)源免疫沉淀實驗進行驗證,并對其在信號功能中的作用進行初步探索。
　　對電泳分離的免疫沉淀復合物用考馬斯亮藍染料染色處理之后,對30個差異蛋白條帶進行了膠內(nèi)酶切和質(zhì)譜鑒定,共鑒定出246個有意義的蛋白質(zhì),這些差異蛋白質(zhì)的功能分類如下:與細胞代謝相關的54個,與細胞結(jié)構

5、蛋白相關的11個,與蛋白降解系統(tǒng)相關的12個,與信號傳導相關的29個,與轉(zhuǎn)錄和翻譯相關的55個。在這些蛋白質(zhì)中,有些與CD40信號轉(zhuǎn)導通路有關,如:MAPKK1、JNK(stress-activated protein kinase,SAPK)、PI3K等;有些蛋白與細胞死亡相關,如Dynactin。這些蛋白為研究CD40信號轉(zhuǎn)導通路及其在疾病發(fā)生中的作用提供了重要線索,對差異的蛋白質(zhì)進行細胞水平的驗證以及在相關信號轉(zhuǎn)導通路中的具體作用

6、還需要進一步更深入的研究。
　　細胞膜上的CD40分子與其配體結(jié)合后,可以使CD40分子之間交聯(lián)產(chǎn)生三聚化,進而招募接頭蛋白TRAFs及NEMO,而TRAFs及NEMO的泛素化是CD40分子誘導的不同信號通路激活的重要事件,因而作為質(zhì)譜鑒定出的差異蛋白中與泛素相關的一些蛋白,如NEDD4、USP9X、E4B等就成為本研究的重要焦點;而ROCKs是RhoA的直接下游靶蛋白,參與多種細胞功能,如平滑肌的收縮,細胞骨架的構建,細胞的粘附

7、與運動等,且越來越多的實驗證據(jù)表明ROCKs在發(fā)育過程及其它許多生理病病理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,但是它發(fā)揮作用的具體機制尚不明確,所以質(zhì)譜鑒定出的差異蛋白ROCK1也稱為本研究的另一焦點。應用體內(nèi)免疫共沉淀實驗對NEDD4、USP9X、E4B及ROCK1進行驗證,結(jié)果顯示出NEDD4及ROCK1均與CD40有相互作用,且這種相互作用不依賴于CD40配體的刺激;USP9X和E4B在本實驗條件下沒有顯示出相互作用(結(jié)果未展示)。

8、　　NEDD4通過內(nèi)源免疫沉淀實驗驗證后,本研究又用外源共轉(zhuǎn)染NEDD4質(zhì)粒及NEMO、IKK?、IKKα、TRAF2、TRAF3等的質(zhì)粒進行免疫共沉淀的方法,發(fā)現(xiàn)NEDD4與NEMO、TRAF3之間有相互作用,而與TRAF2無相互作用(TRAF2、TRAF3與NEDD4間的相互作用由本實驗室方迪峰碩士完成),而且NEDD4能夠使NEMO、TRAF3發(fā)生泛素化(NEDD4對TRAF3的泛素化由本實驗室方迪峰碩士完成)。接著為了探討NED

9、D4在通路中的作用,又構建了慢病毒三質(zhì)粒載體系統(tǒng)用來建立NEDD4穩(wěn)定干涉的A20亞細胞系,但遺憾的發(fā)現(xiàn),由于慢病毒作用A20細胞后,引起細胞中CD40分子蛋白表達量上調(diào),使得此穩(wěn)定細胞系不適合用來進行CD40信號通路的探討研究;為此我們又設計了針對NEDD4的特異siRNA對A20細胞進行瞬時干涉,接著用CD40配體去刺激細胞然后檢測通路變化,結(jié)果沒有檢測到明顯的變化;在NEDD4-/-的MEF細胞中TNF通路及EGF通路也沒有檢測到

10、明顯的變化。
　　為了進一步研究ROCK1在CD40信號通路中的功能,本研究利用ROCK的抑制劑Y-27632預處理A20細胞,發(fā)現(xiàn)添加了抑制劑Y-27632之后,CD40通路下游p-JNK的激活受到了一定程度的抑制。
　　本研究應用高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術鑒定了246個可能的CD40信號復合體中新組分,并對差異蛋白NEDD4及ROCK1的功能進行了初步研究,為以后深入研究CD40信號通路的分子機制和作用,以及為尋找疾病診