高頻率LOH位點D4S2964中肝癌抑制基因的鑒定.pdf

1、目的：肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)簡稱肝癌，是原發(fā)性肝癌中的一種，占其中的90％以上。肝癌為我國最常見的惡性腫瘤之一，研究顯示，肝癌的死亡率在我國呈上升趨勢，其在九大惡性腫瘤死亡率的排名中已從第三位上升到第二位。在全世界范圍內(nèi)，肝癌的死亡率在所有腫瘤死亡率中排名第三。肝癌的發(fā)生是一個多基因、多途徑、多階段的復(fù)雜過程，主要包括環(huán)境因素和遺傳因素的相互作用。已有的研究表明肝癌的發(fā)生與慢性肝炎病毒感染(

2、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒)、黃曲霉毒素攝入及長期大量飲酒等環(huán)境因素相關(guān)。在遺傳因素中，起核心作用的是抑癌基因的失活和癌基因的激活。染色體中DNA的丟失是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，大多數(shù)的抑癌基因都位于高頻的缺失區(qū)。在惡性腫瘤中，分析等位基因雜合性缺失(Loss ofHeterozygosity，LOH)已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)與鑒定新的腫瘤抑制基因最重要的手段之一。在人肝癌相關(guān)的腫瘤抑制基因的研究中，肝癌LOH研究結(jié)果已成為尋找新的肝癌相關(guān)腫瘤抑制

3、基因的重要基礎(chǔ)。最早用于LOH分析的是限制性酶切片段長度多態(tài)性標(biāo)志(restriction fragment length polymorphism，RFLP)，然后是微衛(wèi)星多態(tài)性標(biāo)志。隨著人類基因組計劃的完成，出現(xiàn)一個全新的遺傳多態(tài)性標(biāo)志——單核甘酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)標(biāo)志，它在基因組中廣泛分布，具有密度高，遺傳穩(wěn)定性好、可大規(guī)模檢測等特性，因而已成為LOH分析中廣泛應(yīng)用的

4、新的遺傳標(biāo)志。在前期工作中，我們發(fā)現(xiàn)位于4q21區(qū)帶的微衛(wèi)星標(biāo)志D4S2964位點在肝癌中的LOH頻率高達(dá)50％，而且與HBV感染有關(guān)。根據(jù)腫瘤遺傳學(xué)理論和實驗依據(jù)，我們推測此區(qū)域含有肝癌特異相關(guān)的抑癌基因。本論文的目的在于首先應(yīng)用自制的SNP芯片對該區(qū)域內(nèi)所有基因進(jìn)行LOH分析以便精細(xì)定位出可能的候選抑癌基因，然后分析候選基因在臨床中的作用與體外功能，從而鑒定出位于此區(qū)域內(nèi)的肝癌特異相關(guān)的抑癌基因。
　　 方法：在導(dǎo)師前期研究

5、工作的基礎(chǔ)上，首先從美國生物技術(shù)信息中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫中選擇49個位于D4S2964位點8 Mb范圍內(nèi)的基因，再從這49個基因中選取440個SNP標(biāo)志，在本實驗室制作出SNP芯片。應(yīng)用此SNP芯片對112例肝癌進(jìn)行檢測，并分析這49個基因的LOH頻率。對高頻率LOH的基因與肝癌臨床資料進(jìn)行相關(guān)性分析，找出與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因，然后進(jìn)行表達(dá)情況的驗證，以初步鑒定出候選抑癌基因。對候選抑癌基因進(jìn)行細(xì)胞功能等方面的驗證，并對其調(diào)

6、控的細(xì)胞信號通路進(jìn)行了初步探討。
　　 結(jié)果：
　　 ⑴基因LOH與臨床參數(shù)之間的關(guān)系：對D4S2964位點附近49個基因的LOH頻率進(jìn)行了精細(xì)定位，發(fā)現(xiàn)多個基因的LOH與臨床參數(shù)及病人預(yù)后相關(guān)。其中，多個基因的LOH與腫瘤大小相關(guān)，包括ART3，NUP54，SCARB2和CCDC158(P=0.043和P=0.019，P=0.001，P=0.037)。而基因CCNI和SEC31A的LOH更常發(fā)生于HBsAg陽性病人中(

7、P=0.037和p=0.013)。Kaplan-Meier曲線顯示基因ARD1B和SEPT11的LOH與HCC病人較差的預(yù)后相關(guān)(P=0.021和P=0.004)。Cox回歸分析顯示，基因ARD1B和SEPT11的LOH都與HCC病人的總生存相關(guān)(P=0.006和P=0.026)。
　　 ⑵候選肝癌抑癌基因HPSE的鑒定：HPSE在肝癌中LOH頻率較高，同時表達(dá)也下調(diào)。在mRNA水平上，所檢測的112例肝癌中，74.1％表達(dá)下調(diào)

8、。在蛋白水平上，66.3％病人的表達(dá)水平在腫瘤組織中明顯減少。Kaplan-Meier曲線顯示，HPSE mRNA和蛋白的表達(dá)以及SNP基因型都與HCC病人預(yù)后相關(guān)(P=0.009和P=0.024，P=0.008)。Cox多因素回歸分析也表明，HPSE的蛋白表達(dá)水平和位于HPSE中的SNP(rs9991877)基因型均為HCC病人的獨立預(yù)后因素之一(P=0.041和P=0.007)。
　　 ⑶候選肝癌抑癌基因CCDC158的鑒定

9、：在肝癌的腫瘤標(biāo)本中，CCDC158基因有較高頻率的LOH、DNA拷貝數(shù)減少和mRNA表達(dá)下調(diào)。其中mRNA的表達(dá)與血清AFP、轉(zhuǎn)移及HBV感染有關(guān)。Kaplan-Meier曲線顯示，CCDC158 mRNA的低表達(dá)與HCC病人較差的預(yù)后相關(guān)(P=0.014)。在細(xì)胞功能上，在肝癌細(xì)胞SK-Hep-1中上調(diào)CCDC158基因的表達(dá)，可減慢腫瘤細(xì)胞生長、減弱細(xì)胞克隆形成能力及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對高表達(dá)CCDC158的細(xì)胞與對照細(xì)胞進(jìn)行全基因組

10、表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)多個凋亡相關(guān)分子表達(dá)改變，提示CCDC158基因可能參與凋亡通路的調(diào)節(jié)。
　　 結(jié)論：
　　 位點D4S2964附近多個基因的缺失及表達(dá)與肝癌臨床參數(shù)及預(yù)后相關(guān)，該位點是一個與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的重要區(qū)域：ARD1B和SEPT11的雜合性丟失與肝癌的預(yù)后相關(guān)，其中ARD1B是肝癌的獨立預(yù)后因素；基因HPSE在肝癌中不僅存在高頻率缺失而且表達(dá)明顯降低，是肝癌的獨立預(yù)后因素，可作為肝癌相關(guān)的候選抑癌基因；基