低劑量十溴聯(lián)苯醚孕期及哺乳期暴露對胎盤NO和ET-1及子鼠海馬cofilin-1和Vimentin的影響.pdf

1、背景:
　　1.多溴聯(lián)苯醚（Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）概述
　　溴系阻燃劑近年來得到越來越多學(xué)者的關(guān)注與研究。多氯聯(lián)苯醚（Polychlorinated biphenyls，PCBs）是應(yīng)用最早的阻燃劑，被廣泛應(yīng)用于電介質(zhì)，如電容器、變壓器和電動馬達中。但因為發(fā)現(xiàn)這類阻燃劑是一種持久性有機污染物，會對環(huán)境及人體造成毒害作用，因此美國國會和針對持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約分別

2、于1979年和2001年禁止了PCBs的生產(chǎn)。多溴聯(lián)苯醚（Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）是一系列含有溴原子的芳香族化合物，它與多氯聯(lián)苯醚具有相類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，作為多氯聯(lián)苯醚的替代品，多溴聯(lián)苯醚具有優(yōu)異的阻燃性能。PBDEs可在高溫狀態(tài)下釋放自由基，從而阻斷燃燒反應(yīng)，因此在產(chǎn)品制造過程中，PBDEs常被用于添加到復(fù)合材料中，以提高產(chǎn)品的防火性能。一般將十溴聯(lián)苯醚（decabrominated d

3、iphenyl ether，PBDE-209）以下低溴含量的各類多溴聯(lián)苯醚稱為低溴聯(lián)苯醚，只有PBDE-209是一個完全溴化的多溴聯(lián)苯醚品種。工業(yè)化生產(chǎn)的多溴聯(lián)苯醚中，最常用的為五溴、八溴和十溴聯(lián)苯醚三個品種。已有研究發(fā)現(xiàn)，多溴聯(lián)苯醚的溴化程度越低，其燃燒時生成二惡英的機率越大，毒性越高。低溴聯(lián)苯醚能更有效地在生物體內(nèi)積累，影響甲狀腺的激素水平，并具有較高的生殖及神經(jīng)系統(tǒng)毒性。2009年5月，《關(guān)于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》中，

4、四溴、五溴、六溴、七溴及八溴聯(lián)苯醚被列入受控名單范圍內(nèi)。PBDE-209是多溴聯(lián)苯醚家族中含溴原子數(shù)最多的一類化合物，由于它價格低廉、性能優(yōu)越且急性毒性在所有溴聯(lián)苯醚中最低，因此在全球范圍內(nèi)使用最為廣泛，已越來越廣泛的應(yīng)用于各種消費產(chǎn)品中，包括建材、家具、電子、汽車、塑料、飛機、聚氨酯泡沫和紡織品等。據(jù)統(tǒng)計，PBDE-209占阻燃劑總量的75％以上。
　　2.多溴聯(lián)苯醚的物理化學(xué)性質(zhì)
　　PBDEs的化學(xué)通式是C12 H(0

5、-9) Br(1-10) O，其中溴原子和氫原子之和為10（結(jié)構(gòu)式如圖1）。依據(jù)苯環(huán)上溴原子位置和取代數(shù)目的不同，共有四溴聯(lián)苯醚、五溴、六溴、八溴、十溴等209種同系物，分子量自249到959不等。PBDEs高溫下可釋放溴原子從而驅(qū)散電子，起到滅火功能，高溴化PBDEs在光照下可形成低溴化PBDEs。PBDEs的沸點在310～425℃之間，揮發(fā)性較小，當吸附于顆粒物上或進入大氣環(huán)境中后，會跟隨大氣環(huán)流進行長距離的遷移，并且遷移距離隨著溴

6、原子數(shù)的增加而減少。PBDEs的化學(xué)性質(zhì)非常的穩(wěn)定，難以通過化學(xué)、物理或生物等方式進行降解。正因如此，PBDEs一旦進入環(huán)境體系,就可在土壤、水體及底泥等環(huán)境介質(zhì)中存留數(shù)年,甚至更長的時間。幾種主要的PBDEs的基本性質(zhì)見下表1。
　　PBDE-209的分子式：C12Br10O，分子量為959.17，不溶于水及一般有機溶劑。高溫時溶于甲苯，二甲苯。理論含溴量83.3%。十溴聯(lián)苯醚的熱穩(wěn)定性非常好，適用于要求加工溫度高的聚合物，被廣

7、泛應(yīng)用于塑料制品、電路板和建筑材料等領(lǐng)域的阻燃劑。2001年，全世界PBDE-209的年需求量估計為56,100噸，其中美洲占24,500噸，亞洲23,000噸，歐洲為7,600萬噸。值得注意的是，環(huán)境中PBDE-209可脫溴降解為毒性更強的四溴、五溴及八溴聯(lián)苯醚（圖2）。這種脫溴作用可能是通過“生物”或“非生物”途徑完成的。PBDE-209與其它PBDEs相同，均具有環(huán)境持久性、難降解性、強親脂性、環(huán)境穩(wěn)定性、生物富集性和高生物毒性等

8、特征，其已成為一類新型持久性有機污染物(Persistent Organic Pollutants, POPs)。
　　3.多溴聯(lián)苯醚的生物毒性效應(yīng)
　　對PBDEs具有生物毒性的猜測始于PBDEs的分子結(jié)構(gòu)（見圖1）和化學(xué)性質(zhì)與PCBs相似（圖3），而PCBs對生物健康有明顯的影響已被證實。有學(xué)者提出，PBDEs與PCBs對生物體有相似的內(nèi)分泌干擾作用，可改變機體內(nèi)血液中甲狀腺激素的動態(tài)平衡，并可影響維生素A的儲備量，而這

9、些因素的改變又將會導(dǎo)致生物體的免疫能力、發(fā)育和繁殖能力及其它一些生理生化過程發(fā)生相應(yīng)的改變。研究表明，PBDEs主要是對人和動物產(chǎn)生甲狀腺毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性和內(nèi)分泌干擾作用，對實驗動物還有致癌性。十溴聯(lián)苯醚(Decabrominated Diphenyl Ether，PBDE-209)是一種環(huán)境持久性有機污染物，妊娠期暴露會在母體內(nèi)蓄積，并可以通過胎盤、臍血及母乳對新生兒結(jié)局及子代遠期生長發(fā)育產(chǎn)生不良影響。
　　第一部分、低

10、劑量十溴聯(lián)苯醚孕期暴露對胎盤NO和ET-1的影響
　　目的：
　　建立低劑量PBDE-209孕期暴露SD（Sprague Dawley, SD）大鼠模型，通過檢測孕鼠胎盤內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)基因及內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）基因的mRNA表達水平，胎盤組織ET-1、eNOS及總一氧化氮（Nitric oxide，NO）表達水平，

11、仔鼠出生體重以評估PBDE-209孕期暴露對母鼠胎盤的影響。
　　材料與方法：
　　1.購買10周齡SD雌性大鼠40只，雄性大鼠20只，飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心SPF級動物房內(nèi)。將雌雄大鼠按2：1合籠（每籠3只），頭天傍晚5點將雌鼠放入雄鼠籠中，次日晨9點前取出，雌鼠進行陰道分泌物涂片檢查，將分泌物涂于干凈載玻片上，倒置顯微鏡下見雄鼠精子滿視野視為妊娠第1日，取出單獨飼養(yǎng)，未孕者仍與雄鼠合籠，直至受孕。
　　2.

12、將妊娠第1天的10周齡雌性SD大鼠40只隨機分成5組，每組8只，A組：空白對照組（正常飼養(yǎng)組）；B組：精煉花生油5ml/（kg·d）灌胃；C組、D組及E組分別給予1、5及10mg/（kg·d）十溴聯(lián)苯醚灌胃（溶于等量精煉花生油）。B組、C組、D組及E組母鼠自妊娠第1天至妊娠第22天每日按上述劑量灌胃。
　　3.于妊娠第22天下午各組母鼠剖宮產(chǎn)，取胎盤及仔鼠并計數(shù)、稱重，以初步了解胎盤功能。
　　4.各組胎盤分成三部分。一部分

13、制成石蠟切片，之后利用免疫組織化學(xué)染色法觀察胎盤ET-1及eNOS表達情況；一部分錫紙包裹后儲于液氮罐中，組織勻漿后利用酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)檢測胎盤中總NO含量；另一部分提取RNA，利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR）技術(shù)，檢測胎盤中ET-1基因及

14、eNOS基因mRNA的表達水平。
　　結(jié)果：
　　與A組（6.24±0.384）比較，D組（5.49±0.498）及E組（5.45±0.455）仔鼠平均出生體重下降（P＜0.05）。與A組（1.000±0.000）比較，C組、D組及E組母鼠胎盤組織ET-1 mRNA的相對定量值[（1.580±0.039）、（1.680±0.086）及（1.912±0.097）]均升高（t分別＝-21.234、-11.230及-13.358，

15、均P＜0.05）；與A組（1.000±0.000）比較，C組、D組及E組母鼠胎盤組織eNOS mRNA的相對定量值[（0.867±0.019）、（0.792±0.058）及（0.729±0.059）]均下降（t分別＝9.341、4.685及3.537，均P＜0.05）；與A組（1.00±0.00）比較，C組、D組及E組胎盤組織ET-1表達水平[（1.53±0.13）、（2.14±0.21）及（2.57±0.15）]均升高（t分別＝3.1

16、52、4.783及5.432，均P＜0.05）；與A組（1.00±0.00）比較，C組、D組及E組胎盤組織eNOS表達水平[（0.82±0.11）、（0.64±0.12）及（0.49±0.20）]均下降（t分別＝5.884、6.873及8.368，均P＜0.05）。與A組（27.179±1.226）比較，D組及E組胎盤組織NO表達水平[（79.744±0.577）及（98.141±1.442）]均升高（t分別＝-77.587及-74.9

17、84，均P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　孕期PBDE-209暴露影響胎盤ET-1基因及eNOS基因的表達，從而影響胎盤功能，降低子代出生體重。
　　第二部分、低劑量十溴聯(lián)苯醚孕期及哺乳期暴露對子鼠海馬cofilin-1和Vimentin的影響
　　目的：
　　探討母鼠妊娠期及哺乳期十溴聯(lián)苯醚暴露對仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響的可能作用機制。
　　材料與方法：
　　1.購買10周齡SD雌性大鼠40只，雄

18、性大鼠20只，飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心SPF級動物房內(nèi)。將雌雄大鼠按2：1合籠（每籠3只），頭天傍晚5點將雌鼠放入雄鼠籠中，次日晨9點前取出，雌鼠進行陰道分泌物涂片檢查，將分泌物涂于干凈載玻片上，倒置顯微鏡下見雄鼠精子滿視野視為妊娠第1日，取出單獨飼養(yǎng)，未孕者仍與雄鼠合籠，直至受孕。
　　2.將妊娠第1天的10周齡雌性SD大鼠40只隨機分成5組，每組8只，A組：空白對照組（正常飼養(yǎng)組）；B組：精煉花生油5ml/（kg·d）灌

19、胃；C組、D組及E組分別給予1、5及10mg/（kg·d）十溴聯(lián)苯醚灌胃（溶于等量精煉花生油）。B組、C組、D組及E組母鼠自妊娠第1天至仔鼠斷乳（分娩后28天）每日按上述劑量灌胃。
　　3.胃灌結(jié)束后，每組隨機選取20只仔鼠（雌、雄仔鼠各10只），利用Morris水迷宮試驗對其學(xué)習(xí)記憶能力進行檢測。
　　4. Morris水迷宮試驗結(jié)束后，每組上述子鼠取海馬組織，采用實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測海馬組織絲切蛋白-1（

20、cofilin-1）和波形蛋白（Vimentin）的mRNA及蛋白表達水平。
　　結(jié)果：
　　與A組比較，D組及E組仔鼠平均逃避潛伏期時間延長（P＜0.05）；與A 組（1.000±0.000）比較，C組、D組及E組仔鼠海馬組織Cofilin-1mRNA的相對定量值[（0.888±0.045）、（0.787±0.041）及（0.610±0.021）]均下降（t分別＝－2.904、－4.555及－3.131，均P＜0

21、.05）；與A組（1.000±0.000）比較，C組、D組及 E組仔鼠海馬組織Vimentin mRNA的相對定量值[（0.634±0.031）、（0.428±0.022）及（0.291±0.034）]均下降（t分別＝－20.168、－45.852及－36.457，均P＜0.01）；與A組（1.60±0.07）比較，D組及E組仔鼠海馬組織Cofilin-1蛋白表達水平[（0.88±0.14）及（0.37±0.13）]均下降（t分別＝3.