維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)功能位點對植物生長及光系統(tǒng)Ⅱ活性影響的研究.pdf

1、維生素K環(huán)氧化物還原酶(Vitamin K epoxide reductase，VKOR)是存在于高等動物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的整合膜蛋白，在高等植物中，VKOR的同源蛋白則定位于葉綠體類囊體膜上。擬南芥VKOR(AtVKOR)的缺失會造成植株生長遲緩、植株矮小、花期晚等生長缺陷。AtVKOR具有氧化還原酶活性且此活性與蛋白中的保守半胱氨酸直接有關(guān)，而AtVKOR在植物生長過程中的功能是否由氧化還原酶活性引起還未知。為此，我們對AtVKOR編碼序列

2、的半胱氨酸位點進(jìn)行突變、構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥vkor缺失突變體，獲得純合體后，分析轉(zhuǎn)基因植株的生長表型及在不同光強(qiáng)條件下的光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)活性變化，探究了AtVKOR蛋白功能位點對植株的光合生長、PSⅡ活性的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)將AtVKOR編碼基因的半胱氨酸位點(Cysteine，Cys)進(jìn)行突變、構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥vkor缺失突變體，獲得轉(zhuǎn)基因植株。將AtVKOR的8個保守半胱氨酸（兩對位于VKOR

3、膜結(jié)構(gòu)域，兩對位于Trx-like水溶性結(jié)構(gòu)域）和2個非保守半胱氨酸分別或成對突變?yōu)楸彼?Ala)，共構(gòu)建了10個cysteine-mutant AtVKORs表達(dá)載體，通過花絮浸染轉(zhuǎn)化擬南芥野生型和vkor突變體的雜合體，獲得種子后，對下一代幼苗進(jìn)行抗生素篩選、外源基因PCR鑒定及vkor突變體背景篩選，在T2代獲得vkor突變體轉(zhuǎn)AtVKORWT和轉(zhuǎn)cysteine-mutant AtVKORs純合轉(zhuǎn)基因植株。
　　(2)轉(zhuǎn)

4、cysteine-mutant AtVKORs對植株生長的影響。野生型AtVKOR(AtVKORWT)轉(zhuǎn)化擬南芥vkor缺失突變體后可以完全補償突變體的生長缺陷，而轉(zhuǎn)cysteine-mutantAtVKORs對植株的生長產(chǎn)生了不同的影響。VKOR結(jié)構(gòu)域上的保守半胱氨酸(Cys109、Cys116、Cys195、Cys198)突變后比Trx-like結(jié)構(gòu)域上的保守半胱氨酸(Cys293、Cys296、Cys316、Cys331)突變對植

5、株生長的影響大，其中轉(zhuǎn)AtVKORC109AC116A和AtVKORC195AC198A幾乎不能補償突變體的生長缺陷，與vkor突變體的表型相似;而Trx-like結(jié)構(gòu)域上保守半胱氨酸突變后能部分補償突變體的生長缺陷;兩個非保守半胱氨酸突變后，幾乎能夠完全恢復(fù)突變體的生長，與轉(zhuǎn)AtVKORWT的表型相似。結(jié)果說明保守半胱氨酸特別是VKOR結(jié)構(gòu)域的保守半胱氨酸對植物VKOR蛋白的功能起關(guān)鍵作用，暗示vkor突變體生長缺陷表型是由AtVKO

6、R的氧化還原酶的活性位點突變引起的。
　　(3) AtVKOR半胱氨酸位點對植物光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應(yīng)中心活性的影響。葉綠素?zé)晒鈪?shù)反映植物PSⅡ反應(yīng)中心的活性，與轉(zhuǎn)AtVKORWT葉片的熒光參數(shù)相比，突變不同位點的cysteine-mutant AtVKORs對其熒光參數(shù)產(chǎn)生不同影響。正常光照下，VKOR結(jié)構(gòu)域的保守半胱氨酸突變后對其最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)影響顯著，其中AtVKORC109AC116A和AtVKORC195

7、AC198A的Fv/Fm分別比AtVKORWr下降約24％和22％;Trx-like結(jié)構(gòu)域的保守半胱氨酸突變后，F(xiàn)v/Fm下降10％至13％;非保守半胱氨酸突變后，F(xiàn)v/Fm值與AtVKORWT無顯著差異;強(qiáng)光處理加劇了轉(zhuǎn)cysteine-mutant AtVKORs植株之間的Fv/Fm值的差異。實際光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)的變化趨勢與Fv/Fm的相似。
　　(4) AtVKOR半胱氨酸位點對PSⅡ核心蛋白-D1周轉(zhuǎn)的影響。D1蛋白

8、周轉(zhuǎn)是植物減少光抑制的有效途徑之一。與轉(zhuǎn)AtVKORWT植株相比，強(qiáng)光下轉(zhuǎn)AtVKORC109AC116A和AtVKORC195AC198A植株中D1蛋白含量大大降低，與vkor突變體的D1含量接近，僅有痕量的D1蛋白存在;Trx-like結(jié)構(gòu)域上的保守半胱氨酸突變后，D1含量略有降低;而非保守半胱氨酸突變后，植株中D1含量變化趨勢與轉(zhuǎn)AtVKORWT相似。
　　(5) AtVKOR半胱氨酸位點對植株體內(nèi)活性氧(ROS)積累量的影

9、響。植物光抑制伴隨活性氧的積累，AtVKOR保守半胱氨酸突變后，植株中H2O2和O2·-的積累量顯著增加;特別是成對突變VKOR結(jié)構(gòu)域的保守半胱氨酸后，植株中的ROS積累量與vkor突變體中相當(dāng)，比轉(zhuǎn)AtVKORWT增加約56％。突變非保守半胱氨酸后，植株的ROS積累量與未突變的AtVKORWT維持相似水平。
　　研究結(jié)果表明，AtVKOR蛋白中的半胱氨酸殘基特別是VKOR膜結(jié)構(gòu)域中的保守半胱氨酸對該蛋白在植物生長發(fā)育中的功能影響