草酸鈣尿石癥患者腎臟組織中維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物亞單位1的初步研究.pdf

1、第一部分草酸鈣尿石癥患者腎臟組織中維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物亞單位1（VKORC1)基因的表達研究
　　 目的:對維生素K 環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物亞單位1在草酸鈣尿石癥患者腎臟組織中的表達進行檢測，探討維生素K 環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物亞單位1（VKORC1)與草酸鈣尿石形成之間的關(guān)聯(lián)性。
　　 方法:收集2004年11月至2010年4月武漢同濟醫(yī)院腎臟組織標本155例，分成3組：結(jié)石組、對照組A (非結(jié)石性腎積水組)和對照

2、組B（正常對照組），應(yīng)用免疫組織化學(xué)分析法、免疫熒光顯微鏡檢查法、蛋白質(zhì)印跡法 (western blot)和SYBR GreenI 熒光實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (realtime RT-PCR)技術(shù)對腎臟組織中VKORC1 蛋白進行定位和表達差異的研究。
　　 結(jié)果:免疫組織化學(xué)分析法和免疫熒光顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)在結(jié)石組和對照組腎臟組織中都有VKORC1表達，主要存在于腎小管上皮細胞的細胞質(zhì)內(nèi)；蛋白質(zhì)印跡法提示在結(jié)石組患者腎臟組織

3、中VKORC1 蛋白的表達（0.327±0.055）明顯低于其他2個對照組（0.913±0.090、0.983±0.117），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；SYBR Green I 熒光實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)提示結(jié)石組患者腎臟組織中的VKORC1 mRNA（倍數(shù)：6.063±5.275）表達明顯低于2個對照組 (倍數(shù)：26.324±10.632、27.167±14.248)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意

4、義。
　　 結(jié)論:VKORC1 主要在腎小管上皮細胞胞質(zhì)內(nèi)表達，草酸鈣尿石癥患者腎臟組織中VKORC1的表達降低，可能與草酸鈣尿石的形成有關(guān)。
　　 第二部分維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物亞單位1（VKORC1)基因剪接異構(gòu)體在草酸鈣尿石癥患者腎臟組織中的表達和鑒定
　　 目的:對維生素K 環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物亞單位1（VKORC1）基因剪接異構(gòu)體在草酸鈣尿石癥患者腎臟組織中的表達和鑒定進行分析研究。
　　

5、 方法:收集2004年11月至2010年4月武漢同濟醫(yī)院草酸鈣尿石癥患者腎臟組織標本65例，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）方法對腎臟組織中的VKORC1基因進行擴增，將PCR產(chǎn)物進行純化回收后，通過直接測序和克隆測序的方法對得到的腎臟組織中VKORC1基因剪接異構(gòu)體進行分析。
　　 結(jié)果:應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)的方法成功在草酸鈣尿石癥患者腎臟組織中擴增出VKORC1基因，并且得到2個剪接異構(gòu)體，經(jīng)過3％ 瓊脂糖凝膠電

6、泳顯示一條約500bp的電泳條帶（V1）和另一條約400bp的電泳條帶（V2），經(jīng)過測序鑒定后發(fā)現(xiàn)二者堿基序列相差110bp，二者其余序列完全一致。
　　 結(jié)論:草酸鈣尿石癥患者腎臟組織中存在VKORC1基因的剪接異構(gòu)體。
　　 第三部分草酸鈣尿石癥患者腎臟組織中維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物亞單位1（VKORC1)基因3’-非翻譯區(qū)（3’-UTR）和5’-非翻譯區(qū)（5’-UTR）的擴增和鑒定
　　 目的:對草酸鈣

7、尿石癥患者腎臟組織中維生素K 環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物亞單位1（VKORC1)基因的3’-非翻譯區(qū)（3’-UTR）和5’-非翻譯區(qū)（5’-UTR）進行擴增和鑒定，探討維生素K 環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物亞單位1基因3’-非翻譯區(qū)和5’-非翻譯區(qū)的分子變異與草酸鈣尿石形成之間的關(guān)系。
　　 方法:收集2004年11月至2010年4月武漢同濟醫(yī)院草酸鈣尿石癥患者腎臟組織標本65例，提取腎臟組織中的總RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，應(yīng)用cDN

8、A末端快速擴增（RACE）方法擴增維生素K 環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物亞單位1（VKORC1)基因3’-非翻譯區(qū)和5’-非翻譯區(qū)，將擴增得到的產(chǎn)物進行純化后測序。測序結(jié)果與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行在線比較，應(yīng)用生物信息學(xué)分析得到的VKORC1基因堿基序列，核苷酸序列則通過Sequencher 軟件進行分析，并且使用BLAST 程序進行堿基比對。
　　 結(jié)果:草酸鈣尿石癥患者腎臟組織中VKORC1 擴增后分別在3’端和5’端得到299bp

9、和422bp的堿基片段，經(jīng)過排序和拼接，得到草酸鈣尿石癥患者腎臟組織中VKORC1基因的cDNA全長，測序后得到證實。獲得的VKORC1基因cDNA全長1174bp，包含492 bp的開放閱讀框(ORF，+398 ~+889)，終止密碼子下游279 bp的3’UTR以及起始密碼子上游397 bp的5’UTR。將得到的核苷酸序列進行比對分析后，發(fā)現(xiàn)在得到的VKORC1的3’和5’ UTR 沒有發(fā)現(xiàn)有堿基的插入或缺失，但在 5’ UTR 新