結核分支桿菌HSP65的基因表達及其免疫學特性研究.pdf

1、結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)熱休克蛋白65(Heat Shock Protein 65，HSP65)是熱休克蛋白60家族成員之一，由groEL2基因編碼，是一種高度保守的蛋白質。該蛋白具有很強的免疫原性，在結核桿菌感染過程中，HSP65是機體對抗其入侵的重要的免疫保護性抗原之一，提示HSP65可能成為結核病預防和治療的一個關鍵因素。本研究采用分子生物學方法分別構建MTB HSP65的原核重

2、組質粒和真核重組質粒，測定分析了HSP65蛋白和真核重組質粒在小鼠體內的免疫學特性和抵抗MTB感染的保護力。 1.采用PCR方法從MTB H37Rv株DNA基因組中擴增HSP65基因，與pMD18-T載體連接，酶切鑒定陽性重組質粒pMD-hsp65，經(jīng)測序證實與Genebank公布的MTB HSP65基因序列完全一致。利用酶切位點將HSP65基因從pMD-hsp65中亞克隆入pPRO EX HTa原核表達載體，酶切鑒定陽性重組質

3、粒pPRO-hsp65，并用IPTG進行誘導表達。對表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE的結果表明，在相對分子量為65 Ku的位置有目的蛋白表達。用抗MTB HSP65的mAb及TB患者血清進行Western-blot鑒定，結果證實在相應的位置有特異性的結合條帶。采用Ni-NTA親和色譜柱在變性條件下純化得到了HSP65蛋白。 2.利用酶切位點將HSP65基因從pMD18-hsp65中亞克隆入真核表達載體pcDNA3.1(-)，酶切鑒定

4、陽性重組質粒peDNA-hsp65。將重組質粒用陽離子聚合物法穩(wěn)定轉染P815(H-2d)細胞。分別經(jīng)RT-PCR和間接免疫熒光法證實，該重組質?？稍诜€(wěn)定轉染的P815細胞中轉錄和特異性地表達。經(jīng)過G418壓力篩選，得到8株能穩(wěn)定表達HSP65蛋白的P815細胞系。 3.用HSP65原核表達蛋白及真核重組質粒免疫BALB/c小鼠，并檢測兩種疫苗各項免疫學指標。結果表明，HSP65亞單位疫苗和基因疫苗均可在小鼠體內刺激產(chǎn)生較強的體