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文檔簡介
1、背景:有效治療結(jié)核病必須廣泛深入地理解結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制,確認(rèn)結(jié)核分支桿菌(MTB)存活必需的分子物質(zhì),通過阻斷該分子靶向可抑制MTB的生存。
目的:以發(fā)現(xiàn)MTB在感染宿主及結(jié)核病病程各階段生存的必需基因?yàn)槟康模⒘硕x的MTB突變株庫。通過測試突變株在宿主體內(nèi)和體外應(yīng)激狀態(tài)下的生存能力,鑒別認(rèn)識對MTB適應(yīng)宿主體內(nèi)環(huán)境并生長有重要意義的基因及發(fā)生機(jī)制。
方法:以MTB野生臨床菌株CDC1551為母體,運(yùn)用轉(zhuǎn)
2、移因子插入法建立鑒定MTB突變株庫。制備突變株混合液,感染小鼠、豚鼠及鼠肺巨噬細(xì)胞,并將混合液暴露于0.01%十二烷基硫酸鈉,5mM二酰胺,10 mM枸櫞酸和5%乙醇,應(yīng)用定義突變株分析設(shè)計(jì)隊(duì)列法(Designer Arrays forDefined Mutant Analysis,DeADMAn)及基因芯片技術(shù)和實(shí)時(shí)PCR技術(shù),篩選在小鼠肺、豚鼠肺、活化巨噬細(xì)胞內(nèi)及各種化學(xué)刺激下存活能力顯著降低的突變株,這些突變株涉及的基因是MTB在
3、應(yīng)激狀態(tài)下生存的必需基因。
結(jié)果:鑒定得到轉(zhuǎn)移因子單一突變位點(diǎn)的突變株481株,涉及349個(gè)開放閱讀框的387個(gè)位點(diǎn)。對涉及11個(gè)結(jié)核分支桿菌基因功能分類的186個(gè)獨(dú)立基因的突變株進(jìn)行研究。共發(fā)現(xiàn)MTB在小鼠及豚鼠肺內(nèi)、肺泡巨噬細(xì)胞或化學(xué)刺激下生存的必需基因43個(gè),其中近40%(17/43)參與脂代謝、中間代謝和呼吸功能,17%(7/43)參與細(xì)胞壁代謝。進(jìn)一步的比較分析為認(rèn)識基因功能提供了有力線索,為深入細(xì)致的關(guān)鍵基因產(chǎn)
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