PCR技術(shù)檢測(cè)鹿結(jié)核病及HSP65基因的克隆與表達(dá).pdf

1、本文為確定我國(guó)鹿群的結(jié)核病的流行情況，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)采自國(guó)內(nèi)某一地區(qū)鹿場(chǎng)屠宰點(diǎn)的79份鹿全血樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明鹿群的結(jié)核病陽(yáng)性率為43.0％，其中還有結(jié)核分枝桿菌的感染，證明鹿群中仍然高發(fā)結(jié)核病。 為了有效預(yù)防和治療鹿結(jié)核病，以PCR檢測(cè)鹿結(jié)核病陽(yáng)性分離菌株基因組DNA為模板，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增熱休克蛋白65(Hsp65)基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化與測(cè)序載體PMD18-T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化克隆宿主菌E.coliDH5a

2、中測(cè)序鑒定，結(jié)果堿基序列與GenBank上結(jié)核分枝桿菌HSP65堿基序列100％一致。將連接有HSP65基因的PMD18-T載體和原核表達(dá)載體pGEX-6P-1分別用EcoRI/SaLI雙酶切處理，回收純化后，連接構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化克隆宿主菌E.coliDH5a中，經(jīng)酶切及PCR鑒定為陽(yáng)性克隆后進(jìn)一步測(cè)序鑒定，結(jié)果堿基、預(yù)測(cè)氨基酸序列均與HSP65完全一致，并具有正確的讀碼框，獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-HSP65可用于下步表達(dá)。

3、 大量提取重組質(zhì)粒pGEX-HSP65，將其轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌E.coliBL21中，鑒定為陽(yáng)性克隆后，以1mMol/L終濃度的IPTG37℃誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析，表達(dá)的蛋白條帶大小約86kDa，與預(yù)期的結(jié)果相符，經(jīng)薄層掃描表達(dá)外源蛋白量占全菌體蛋白總量的30.7％。HSP65基因表達(dá)的融合蛋白GST-HSP65經(jīng)過Westernblot檢測(cè)，在86kDa處顯示了特異蛋白結(jié)合帶，表達(dá)的蛋白能被PCR檢測(cè)鹿結(jié)核呈陽(yáng)性的血