煙草脈帶花葉病毒CP基因的原核表達(dá)及免疫金標(biāo)試紙條的研制.pdf

1、煙草脈帶花葉病毒病是由馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的煙草脈帶花葉病毒(Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV)引起的，在我國(guó)很多主產(chǎn)煙區(qū)均有發(fā)生，并且涉及范圍和危害程度呈上升趨勢(shì)。對(duì)該病害進(jìn)行準(zhǔn)確及時(shí)的診斷是有效控制其發(fā)生的重要前提。除TVBMV外，自然侵染煙草的馬鈴薯Y病毒屬的馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y.PVY)和煙草脈斑駁病毒(Tobacco vein mottling

2、 virus，TVMV)等也能引起脈帶癥狀，加上煙草病毒病復(fù)合侵染現(xiàn)象嚴(yán)重，根據(jù)癥狀很難將TVBMV與它們區(qū)分。利用血清學(xué)和分子生物學(xué)等檢測(cè)手段雖然能準(zhǔn)確診斷，但操作復(fù)雜，需要專門的實(shí)驗(yàn)儀器。為建立一種快速、特異、簡(jiǎn)便的檢測(cè)煙草脈帶花葉病毒的方法，本文研制了TVBMV快速檢測(cè)試紙條，研究結(jié)果如下： 利用RT-PCR方法獲得了煙草脈帶花葉病毒(TVBMV)陜西分離物的外殼蛋白(CP)基因。序列分析表明，TVBMV陜西分離物的CP基

3、因全長(zhǎng)為816 bp，與GeneBank中己報(bào)道的9個(gè)國(guó)內(nèi)外分離物相比，核苷酸和氨基酸序列同源性分別為90.28％-98.15％和97.05％-100％，與山東蒙陰分離物關(guān)系最近。 將TVBMV CP基因克隆到pMD18-T Simple Vector，經(jīng)BamH I/Not I雙酶切得到目的片段，定向插入到pET30a載體中，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET30-TVBMV CP，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。以表達(dá)

4、產(chǎn)物為抗原免疫家兔制備了特異性抗血清。在大腸桿菌中tVBMV CP獲得了高效表達(dá)，分子量約為37 kD，ELISA法測(cè)定抗血清效價(jià)為1/6400。Western-blot檢測(cè)結(jié)果表明，制備的抗血清可用于檢測(cè)發(fā)病植株。 應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)和免疫層析原理，在玻璃纖維膜、硝酸纖維膜的檢測(cè)帶和質(zhì)控帶上分別噴上膠體金與煙草脈帶花葉病毒兔多克隆抗體的偶聯(lián)物、煙草脈帶花葉病毒兔多克隆抗體和羊抗兔IgG，研制出煙草脈帶花葉病毒快速檢測(cè)試紙條。病