6K和P3N-PIPO蛋白調(diào)控煙草脈帶花葉病毒復制和移動的分子機制.pdf

1、馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）是最大植物病毒屬，包含200多種病毒。該屬病毒寄主范圍廣泛，發(fā)生普遍，給作物生產(chǎn)帶來嚴重損失。種植抗病品種是防治作物病毒病最為經(jīng)濟有效的方式。但目前生產(chǎn)中缺乏有效的抗病毒品種。植物病毒需要借助寄主蛋白來完成侵染循環(huán)。沉默或敲除病毒依賴的寄主蛋白可以使植物產(chǎn)生抗性。同時，理解病毒蛋白的分子功能以及病毒與寄主互作的分子機制是研發(fā)新的抗病毒策略的前提。本研究揭示了馬鈴薯 Y病毒屬的煙草脈帶花葉病毒（Toba

2、cco vein banding mosaic virus，TVBMV）在復制和移動兩個病毒侵染關(guān)鍵環(huán)節(jié)中與寄主的相互作用機制。主要研究結(jié)果如下：
　　1、病毒寄主蛋白復合體6K1-6K2-PsbO1調(diào)控病毒復制的分子機制：第一6 kDa蛋白（6K1）包含一個保守的RSD基序。丙氨酸掃描實驗證明該基序中任何一個氨基酸的改變都使 TVBMV復制的復制水平下降。亞細胞定位實驗證明TVBMV6K1單獨瞬時表達時分布在整個細胞之中，然而在

3、病毒侵染過程中被招募到葉綠體并與TVBMV復制相關(guān)第二6 kDa蛋白（6K2）和復制酶核內(nèi)涵體b共定位。6K1能與6K2在體內(nèi)相互作用并被6K2招募到位于葉綠體的病毒復制復合體。免疫共沉淀和質(zhì)譜鑒定表明本氏煙光系統(tǒng) II放氧復合體蛋白（ Photosystem II oxygen evolution complex protein of Nicotiana benthamiana， NbPsbO1）存在于6K1-6K2復合體上。NbPs

4、bO1能與TVBMV6K2蛋白互作但不與6K1互作。利用病毒誘導基因沉默降低NbPsbO1基因的表達抑制了馬鈴薯Y病毒屬病毒TVBMV和馬鈴薯 Y病毒基因組 RNA和外殼蛋白在植株中的積累量，但并不影響馬鈴薯X病毒屬的馬鈴薯 X病毒基因組RNA和外殼蛋白的積累量。光系統(tǒng)II放氧復合體的另外兩個元件NbPsbP1和NbPsbQ1不能與6K2互作，而且沉默NbPsbP1和NbPsbQ1基因不影響TVBMV復制。
　　2、病毒寄主蛋白復

5、合體P3N-PIPO-CI-NbDREPP調(diào)控TVBMV細胞間移動的作用機制：TVBMV的PIPO結(jié)構(gòu)域由60個氨基酸位點組成。含有由7個、20個或43個氨基酸組成的PIPO結(jié)構(gòu)域的TVBMV突變體喪失了細胞間移動和系統(tǒng)侵染能力。但這些突變體的復制水平與野生型TVBMV一致。本氏煙發(fā)育調(diào)控質(zhì)膜蛋白（Developmentally regulated plasma membrane protein of N. benthamiana， N

6、bDREPP）能與TVBMV P3N-PIPO和柱狀內(nèi)涵體蛋白CI互作。沉默NbDREPP 基因抑制了TVBMV的細胞間移動和系統(tǒng)侵染。NbDREPP自身定位在細胞壁上，能與胞間連絲定位蛋白PDLP1共定位，而且能與P3N-PIPO和CI共定位于胞間連絲。早期分泌途徑抑制劑Brefeldin A處理或瞬時過表達顯性負抑制突變體ADP核糖基化因子1（ADP-ribosylation factor1）-T31N或分泌相關(guān)ras超家

7、族相關(guān)基因1b（Secretion-associated and ras superfamily-related gene1b）-H74L都破壞了NbDREPP的胞間連絲定位。微絲骨架抑制劑Latrunculin B處理或過表達顯性負抑制突變體肌球蛋白XI-2尾部結(jié)構(gòu)域也破壞了NbDREPP的胞間連絲定位。
　　3、通過新一代測序技術(shù)比較野生型 TVBMV和弱毒突變體侵染植物后的轉(zhuǎn)錄組變化揭示了TVBMV的癥狀形成機制。輔助成分蛋

8、白酶（helper component proteinase，HCpro）是TVBMV的RNA沉默抑制子。通過定點突變技術(shù)在TVBMV侵染性克隆pCamTVBMV-GFP（pCamT-WT）HCpro編碼區(qū)引入突變，獲得突變體pCamTVBMV-GFP-HCproD198K+DE250-251（pCamT-HCm）。這些氨基酸的改變破環(huán)了HCpro的RNA沉默抑制活性而且使T-HCm在本氏煙上的癥狀明顯減輕。我們通過轉(zhuǎn)錄組測序比較了T-

9、WT和T-HCm侵染本氏煙1天、2天和10天后的基因表達變化。在T-WT或 T-HCm侵染后1天和2天，與蛋白翻譯相關(guān)的基因上調(diào)表達；而與脂質(zhì)代謝以及胞內(nèi)刺激反應相關(guān)基因下調(diào)表達。在病毒接種后10天，T-WT的侵染抑制了光合合成相關(guān)基因的表達，而 T-HCm的侵染對光合合成相關(guān)基因無明顯影響。T-WT的侵染使RNA沉默相關(guān)途徑的關(guān)鍵基因DCL2、DCL4、RDR1和AGO1上調(diào)表達；而T-HCm的侵染對這些基因的表達無影響。T-WT的侵

10、染也使水楊酸和乙烯信號途徑中的相關(guān)基因上調(diào)表達，但使茉莉酸信號途徑的相關(guān)基因下調(diào)表達。T-WT和 T-HCm的侵染差異調(diào)控了生長素信號轉(zhuǎn)導途徑中相關(guān)基因的表達，這與TVBMV引起的矮化癥狀有關(guān)。
　　綜上所述，TVBMV劫持寄主因子NbDREPP和NbPsbO1用于自身細胞間移動和復制，DREPP和PsbO1可以作為抗TVBMV的新靶標。TVBMV的侵染干擾了植物的卡爾文循環(huán)、葉綠素代謝以及生長素信號轉(zhuǎn)導途徑導致植物產(chǎn)生褪綠和矮化